2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM）的发病率和死亡率居世界前十,常伴有心脑血管疾病、失明、截肢等并发症而导致残疾,在全球范围内构成了严重的健康和经济挑战^[1]。据中国一项调查资料显示,2013年我国成年人糖尿病标化患病率高达10.9%,其中T2DM比例达到90%以上^[2]。另外一项在全球范围内的研究估计,在2013年中国有0.984亿的成年人患糖尿病,到2035年将达到1.427亿人,中国已成为糖尿病患者人数最多的国家^[3]。因此,迫切需要制定控制疾病发生发展的方法。免疫系统与全身代谢的双向作用多年来已被公认,免疫失衡-代谢负荷在T2DM的胰岛素抵抗（Iusulin resistance,IR）和胰岛β细胞损伤中的作用也逐渐得到重视^[4,5],免疫代谢是目前癌症、糖尿病和肥胖等多种疾病的一种新的治疗靶点。此外,一项重要的研究明确了炎症信号通路与糖代谢的关系,T2DM作为一种慢性炎症性疾病得到广泛认可^[6]。T2DM是先天免疫系统普遍激活的结果,其中也存在着细胞因子介导的慢性炎症^[7,8]。因此可以看出,免疫系统和炎症机制都参与了T2DM的发生和发展。大量证据表明内源性阿片肽和阿片结合位点在包括人类在内的多种动物的内分泌腺体胰腺中均有表达^[9,10],内源性阿片肽通过与阿片受体结合来发挥作用,提示这些肽也可能在胰腺的分泌调节中发挥作用,从而影响糖代谢。蛋氨酸脑啡肽（Methionine enkephalin,MENK）是一种由五个氨基酸tyr-ala-ala-pheo-met组成的内源性阿片肽,由前脑啡肽衍生而来。已有研究表明MENK是免疫和神经内分泌系统之间的重要中介,通过与阿片类受体delta（d-,DOR）,kappa（k-,KOR）和mu（m-,MOR）结合来调节先天和适应性免疫^[11]。MENK是一种免疫调节因子,可调控树突状细胞、巨噬细胞和CD4⁺T淋巴细胞,以及活化和调节上皮细胞及间充质细胞^[12-16]。自身免疫性慢性炎性疾病的发生发展近年来被认为是因为激活了自身反应性CD4⁺T辅助细胞（T helper cell,Th）^[17,18]。目前已知幼稚Th0细胞在细胞因子的影响下可以分化为特定的Th细胞亚群,如Th1、Th2、Th17、Th22和Treg等^[19]。Th1细胞可以产生促炎细胞因子,如IFN-γ、TNF-a、IL-2等,支持细胞免疫,促进炎症反应、细胞毒性反应和迟发性超敏反应。Th2细胞可以分泌抗炎细胞因子,如IL-4、IL-5、IL-10和IL-13等,支持体液免疫,下调Th1细胞支持的炎症反应^[20-22],Th1/Th2细胞比例平衡对维持机体免疫稳态具有重要意义。最近的研究表明胰岛间充质细胞来源的IL-33在胰岛中能够协调免疫与代谢之间的相互作用,当处于糖尿病环境（葡萄糖、IL-1β和棕榈酸刺激）时胰岛间充质细胞产生IL-33明显加强^[23]。II型固有淋巴样细胞（Group II innate lymphoid cells,ILC2s）是连接先天性免疫与适应性免疫应答间的细胞,其作为二者间的桥梁被认为是第一个激活Th2型细胞免疫反应的细胞,能够强化机体免疫反应,延缓适应性免疫应答的启动^[24]。研究还发现IL-33在胰岛内的反应细胞为ILC2s,IL-33可以与ILC2s表面的ST2结合诱导Th2反应、促进胰岛素分泌^[23],这样就把胰岛细胞中的免疫和代谢协调起来。IL-33/ST2通路可以防止不适当的、特异性的Th1极化反应,并诱导IL-4和IL-13的产生,由此维持Th2细胞的极化状态。而ILC2s除了产生IL-4和IL-13外还可以分泌MENK,体外实验发现IL-33可以刺激ILC2s使MENK分泌增多^[24]。Toll样受体（TLR）信号通路通过髓样分化因子88（MyD88）和TNF受体相关因子（TRAF）起作用,激活核转录因子-κB（NF-κB）p65,促进细胞因子分泌和炎症反应^[25],而有研究表明ST2可能是Toll样受体（TLR）信号传导的一个强有力的负调控因子,ST2在树突状细胞的表达上调可增加对促炎、刺激诱导成熟的耐受性^[26]。所以MENK可能通过上述途径调节糖代谢,然而到目前为止关于MENK对糖尿病的影响研究很少。目的:研究MENK对T2DM大鼠血糖和胰岛素分泌的影响及高糖高脂诱导损伤的大鼠INS-1细胞胰岛素分泌的作用;进一步探讨MENK的可能作用机制,研究MENK是否通过与阿片受体结合发挥调节免疫作用,并检测MENK对相关免疫学指标Th1和Th2的影响,分析MENK通过影响IL33/ST2通路发挥调节炎症信号通路的作用,从而阐明MENK对T2DM作用的分子机制,为T2DM的治疗提供新的思路和理论依据。本研究分如下三部分进行:第一部分:2型糖尿病与炎症及免疫异常关系的研究。第二部分:蛋氨酸脑啡肽对2型糖尿病炎症及免疫异常干预效应的研究。第三部分:IL-33/ST2通路在蛋氨酸脑啡肽调节2型糖尿病炎症及免疫异常中作用的研究。研究方法:1、高糖高脂饮食喂养联合小剂量链脲佐菌素（STZ）腹腔注射法建立T2DM大鼠模型;2、正常大鼠及T2DM大鼠再随机分为对照组,MENK处理组及MENK+纳曲酮（NTX）处理组;3、记录大鼠体重,血糖仪测定大鼠尾静脉血糖;4、苏木素-伊红（HE）染色大鼠胰腺组织研究病理变化;5、免疫组织化学（IHC）染色法研究胰腺组织内三种阿片受体表达部位及表达含量;6、高糖高脂培养诱导大鼠INS-1细胞的体外β细胞损伤模型,并将细胞分组培养于加入MENK及NTX的培养基中;7、葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）实验评估高糖高脂培养对INS-1细胞的功能损伤;8、酶联免疫吸附实验（ELISA）检测大鼠血清及INS-1细胞培养上清液中胰岛素、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-2、IL-5和IL-10含量;9、实时荧光定量聚合酶链反应（real-time RT-PCR）检测大鼠胰腺组织及INS-1细胞内DOR、MOR和KOR三种阿片受体、IL33/ST2及TLR通路相关分子-MyD88、TRAF6及NF-κB p65的基因表达量;10、Western blot方法检测大鼠胰腺组织及INS-1细胞内DOR、MOR和KOR三种阿片受体、IL33/ST2及TLR通路相关分子-MyD88、TRAF6及NF-κB p65的蛋白表达量。结果:1、MENK对大鼠的作用1.1高糖高脂喂养联合小剂量STZ腹腔注射可成功建立T2DM大鼠模型,T2DM大鼠的血糖升高达到模型标准,多尿、多饮、多食及体重下降的典型糖尿病症状明显,血清胰岛素水平较正常组下降;应用不同剂量MENK腹腔注射均能降低T2DM大鼠的血糖水平,增加血清胰岛素水平,同时可改善T2DM引起的体重下降,差异具有统计学意义。1.2 MENK对大鼠胰腺组织形态学的影响:胰腺组织HE染色结果发现,正常大鼠胰腺中可以观察到成团的胰岛β细胞,β细胞的大小一致,核染色质清晰,具有清晰的细胞质边界和清晰的结缔组织。与正常大鼠相比,T2DM大鼠胰岛β细胞分布稀疏且不均匀,数量减少,形态不一,细胞质的界限模糊;MENK处理后的T2DM大鼠的胰岛β细胞数量明显增加,边缘较圆,细胞质稍不均匀,核仁清晰,细胞排列均匀,MENK干预可改善胰腺组织形态,维持其正常功能。1.3阿片受体在大鼠胰腺中的表达:通过IHC染色看出阿片受体DOR、MOR和KOR均在胰腺组织内表达,其中KOR的表达含量很低。结合IHC染色、real-time RT-PCR及Western blot的结果,T2DM大鼠胰腺阿片受体含量较正常大鼠减少,MENK可增加T2DM大鼠阿片受体表达,差异有统计学意义。1.4 T2DM大鼠胰腺内IL-33/ST2通路及TLR通路相关分子-MyD88、TRAF6及NF-κB p65的表达量均较正常大鼠增加;MENK干预减少了T2DM大鼠胰腺内上述分子的表达量。1.5 T2DM大鼠血清中存在明显的Th1/Th2细胞因子平衡紊乱,表现为Th1型细胞因子TNF-a及IL-2升高,而Th2型细胞因子IL-5及IL-10降低;MENK可通过降低血清中TNF-a及IL-2含量及增加IL-5及IL-10的含量来调节Th1/Th2细胞因子的平衡。2、MENK对大鼠INS-1胰岛β细胞瘤细胞的作用2.1高糖高脂培养INS-1细胞后形成明显的糖脂毒性,细胞数量减少,胰岛素分泌量下降;MENK共培养后能够增加细胞数量、改善细胞形态、增加胰岛素分泌量。GSIS实验同样证实MENK可以改善糖脂毒性造成的INS-1细胞胰岛素储备分泌障碍。2.2 MENK可增加高糖高脂培养的INS-1细胞中阿片类受体的表达水平;下调IL-33/ST2通路及TLR通路相关分子-MyD88、TRAF6及NF-κB p65的表达量;MENK可明显调节INS-1细胞分泌的Th1/Th2细胞因子的平衡;以上结果与体内实验结果趋势相符。结论:MENK可通过与阿片类受体结合进而调节免疫反应和抑制炎症反应,达到降低血糖、刺激胰岛分泌胰岛素的作用,MENK可能作为一种治疗T2DM的新方法及辅助其他降糖治疗的手段发挥临床应用潜力。