白色念珠菌(Candida albicans)是艾滋病、癌症等疾病患者以及免疫机能减退人群的重要威胁。目前,形态可塑性被认为是白色念珠菌致病的关键毒性因子。本文以白色念珠菌形态转换不同阶段发挥作用的关键蛋白作为研究对象,首先对第一阶段发挥代谢作用,产生形态转换信号——CO2的尿素酰胺水解酶进行结构解析,分析其发挥作用的分子机制;之后对第二阶段介导免疫逃逸的关键蛋白Pral进行特性及结构分析,探究Pral与补体途径上游蛋白的互作。通过对菌丝生长不同阶段的关键蛋白进行研究,本研究尝试为白色念珠菌发挥致病性的相关机制提供参考和依据。论文第一部分,我们将尿素酰胺水解酶(Urea Amidolyase,UA)作为研究对象。UA所属生物素依赖性羧化酶家族,通过摆臂实现活性位点的偶联和底物的水解,已经是该家族公认的酶活机制,但目前已被解析的多个生物素依赖性羧化酶家族蛋白的结构表明,单纯依靠摆臂模式不足以实现生物素在两个活性位点的转移,生物素羧基载体蛋白(Biotin Carboxyl Carrier Protein,BCCP)也必须在催化过程中移位,这种模式被称为“摆动域”模型。尽管生物素和磷酸泛素依赖酶家族中的多个证据支持这一理论,但目前尚无确切结构证据能够证明“摆动域”的机制。本研究以此为切入点,运用负染电镜单颗粒技术对乳酸克鲁维酵母全长UA(K.lactis Urea Amidolyase,KlUA)的空载状态(KlUA-APO),只添加配体状态(KlUA+ADP)和同时添加底物配体状态(KlUA+ADP+Urea)进行负染观察及单颗粒三维重构,通过比较三种状态下KlUA的结构差异,发现KlUA二聚体中BCCP位置具有不对称性,不添加底物和配体KlUA二聚体内BCCP更加灵活,摆动更加明显,并由此推测,每个单体的BCCP可在生物素羧化酶(Biotin Carboxylase,BC)及羧基转移酶(Carboxyl Transferase,CT)间自发摆动而不依赖于底物或配体的结合,各单体内的BCCP移动不受另一单体的影响,彼此独立进行。该结构特征通过单颗粒三维重构的计算性“纯化”而被捕捉,为UA呈现的的高效酶活提供了结构解释,并在一定程度上为生物素依赖性羧化酶家族的“摆动域”模型提供了结构依据。论文第二部分,我们将pH调节蛋白(pH-regulated antigen,Pral)作为研究对象。Pral作为白色念珠菌表达的内源性补体蛋白抑制剂,在白色念珠菌进行免疫逃逸时发挥关键作用。研究表明,Pral能通过裂解补体蛋白C3,抑制旁路途径(Alternative Pathway,AP)的激活。同时,Pral也被证明能够抑制经典途径(Classical Pathway,CP)和凝集素途径(Lectin Pathway,LP)功能的发挥,对CP/LP途径C3b沉积和免疫吞噬的抑制作用与AP途径相当。为了探究Pral对三种补体途径上游关键蛋白的干扰作用,本研究首先运用原核、真核表达系统对Pral及补体蛋白C2、C4进行载体构建和表达纯化,并对血浆中含量丰富的C3进行提取纯化,分析各蛋白特性,为Pral与补体途径上游关键蛋白的研究提供实验材料。运用酶联免疫吸附实验对Pral与各补体蛋白的相互作用进行分析,结果显示,Pral能够与CP/LP途径补体蛋白C2和C4发生互作,这种相互作用不依赖蛋白本身的糖基化修饰,但需要金属离子的支持,且在种间具有保守型。这些结果初步验证了我们对Pral抑制CP/LP途径的猜想,即Pral可能通过结合补体途径上游C2和C4蛋白,干扰C3转化酶(C4b2a)功能的发挥。随后,我们对Pral蛋白的生化性质进行分析,结果显示,天然状态下的Pral以大于250kDa的多聚体形式存在于溶液中,具有较强的抗还原能力,多聚体的形成不依赖金属离子的结合,当蛋白浓度升高,会产生浓度依赖性沉淀。因补体蛋白C3是各激活途径的交汇,在补体系统中处于核心地位,本研究还尝试运用电镜三维重构技术对Pral裂解C3的分子机制进行解析,我们首先运用同源建模手段预测并分析了 Pral单体的结构特性,随后,通过负染电镜单颗粒技术对血浆中提取纯化的C3蛋白进行三维重构,获得了 C3蛋白在天然状态下的结构模型;最后,我们对C3-Pral复合物的形成条件进行摸索,将浓度比,孵育温度和孵育时间作为变量,最终确定了 C3-Pral复合物进行电镜观察的最佳条件。以上实验结果为下一步C3-Pral复合物的结构解析提供了实验基础及部分初始模型,并为Pral蛋白在免疫逃逸过程中与CP/LP上游补体蛋白C2、C4互作的结构生物学研究搭建了实验体系。