农林废弃木质素资源生物转化合成姜黄素研究

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农林业废弃物资源巨大,其高效利用要面临许多技术困难。其中,木质素是生物质资源中较为丰富的芳香族化合物,其化学结构复杂、转化效率低、成本较高,这成为木质纤维素利用的障碍;且木质素的利用,目前仍处于低附加值产品的开发阶段。姜黄素作为高值化产品之一,具有抗氧化、抗癌、抗菌等多种生物学活性,但是,目前尚未有任何研究以废弃木质素生物质为原料,通过微生物转化木质素并成功合成姜黄素的报道。同时,姜黄素的实际应用还严重受限于其结构不稳定性、纯度低、水溶性差等因素。因此,寻找合适的方法改善姜黄素的水溶特性、合成产物的纯度及其生物利用度,对开发姜黄素在生物医学和食品等领域的应用,具有及其重要的科学价值和广泛的市场应用潜力。针对以上问题,该研究提出了一条全新的木质素生物转化合成姜黄素的工艺路线与方法,其独特的设计是:首先通过木质素解聚产生姜黄素生物合成的前体阿魏酸,然后再通过构建并利用含有不同姜黄素关键合成酶基因的工程菌,对阿魏酸进行生物转化并最终合成姜黄素。同时,针对姜黄素水溶性差的问题,该研究还利用来源于Bacillus subtilits 168的葡萄糖基转移酶对姜黄素进行生物转化,通过对姜黄素的结构进行改造,在保证酶修饰姜黄素抗氧化性能的同时,增加了酶修饰姜黄素的水溶性。该论文的主要研究成果归纳如下:(1)研究并优化了木质素解聚方法,得到了姜黄素生物合成的前体阿魏酸。研究发现,NaOH水溶液和漆酶解聚木质素的最佳条件为:温度为110-120℃,NaOH浓度为2-3%,反应时间90 min左右。解聚产物中检测到阿魏酸、阿魏酸乙酯的存在,且解聚产物中阿魏酸的含量增加了1.02倍,表明木质素解聚后产生了姜黄素生物合成的前体化合物阿魏酸。(2)成功地在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中实现了异源表达4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)、二酮辅酶A合成酶(DCS)、姜黄素合成酶(CURS1、CUS)和糖基转移酶(Bs-Yji C)基因,获得了5株基因工程菌,为后续的姜黄素的合成及其水溶性特性的改善奠定了重要的技术基础。(3)研究结果表明,通过构建4CL-DCS-CURS1三酶共培养体系,获得了目前为止木质素转化为姜黄素的最高产量(2.61 mg/L)。其最佳转化条件为温度26℃,接种比例为10:1:1,该结果表明,论文中提出的木质素转化并合成姜黄素的工艺路线是可行的,具有一定的产业化应用潜力。(4)基于以上的结果,该研究进一步探索并成功建立了生物转化姜黄素的最佳提取分离技术路线。结果表明,树脂YPR-II的吸附率高、反应平衡时间短,适用于姜黄素的初步纯化。树脂静态纯化的最佳条件为:pH为3,温度为30℃,且高浓度乙醇有利于姜黄素的洗脱;其动态纯化的最佳条件为:上样流速1 m L/min,上样体积120 m L,解吸流速2 m L/min,洗脱液体积200 m L。随后经硅胶柱分离和重结晶后,其姜黄素的纯度达到了80.72%。(5)研究结果还表明,通过葡萄糖基转移酶酶的修饰可显著提高姜黄素的水溶性特征,并可有效地清除ABTS、DPPH等多种活性自由基,水溶性的提高显著改善了姜黄素产品的应用可行性。其糖基转移酶转化的最佳转化条件为:温度40℃,pH 8,反应时间为30 min,酶修饰姜黄素的水溶解度分别为49.60mg/L和15.31 mg/L。同时,通过酶修饰的手段,姜黄素良好的抗氧化能力得到了显著的改善,在医药领域展现出良好的应用前景。该研究的创新之处,是以废弃木质素生物质为原料,提出了新的生物转化合成技术途径并实现了姜黄素的有效合成;利用酶的多点位修饰手段改善姜黄素的结构,显著改善了姜黄素产物的水溶性特性并保持其独特的抗氧化能力。因此,该研究成果不仅为姜黄素未来的产业化应用奠定了重要的技术基础,还为农林废弃物的高值化利用提供了一种可能的新途径。
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