1．研究背景 1．1间隙连接的功能及其调节 间隙连接蛋白(connexins)家族成员组装成细胞膜上介导小分子物质(分子量<1000Da)在相邻细胞之间被动扩散的间隙连接(gapjunctions)通道。多细胞生物通过间隙连接通讯(gap junction intercellular communication，GJIC)进行细胞间物质和信息交换，使得细胞对环境刺激的反应协调一致；与此同时细胞之间的GJIC也随环境改变而变化。PH值降低、细胞内钙离子浓度升高和存在跨通道电压等刺激因素通过降低间隙连接通道的通透性，抑制GJIC；而多种与细胞内蛋白激酶激活相关的刺激因素可以通过改变细胞膜上间隙连接通道的数量和通透性，上调或者下调GJIC。 1．2 Cx31．间隙连接的功能及其调节 Connexin31(Cx31)是间隙连接蛋白家族的一员。我们前期的研究表明Cx31是快速更新的动态分子；新合成的Cx31通过内质网一高尔基体分泌途径连续不断地运输到细胞膜组装成间隙连接通道，膜上原有的Cx31间隙连接通道则自细胞膜上除去并降解。人类Cx31间隙连接通道对于小分子缺乏选择性，不同分子量和电荷的染料小分子都可以通过。同其它connexin相似，人类Cx31通道在细胞内PH值降低或者跨通道电压存在的情况下关闭。Simone等报道小鼠Cx31可以在266位丝氨酸残基磷酸化，将此氨基酸突变为不能磷酸化的氨基酸后，Cx31降解速度加快，同时Cx31通道通透性降低；但是没有直接证据表明小鼠Cx31 GJIC受到蛋白激酶调节，而且人类Cx31在266位是不能磷酸化的天冬酰胺。 2.研究目标 为了寻找可以调节人类Cx31 GJIC的刺激因素，我们选择了两个广泛存在的蛋白激酶--蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶C(PKC)，考察了在PKA和PKC激活的条件下，Cx31 GJIC水平、Cx31细胞内分布以及细胞内Cx31蛋白的总量，我们希望确定可以调节Cx31 GJIC的蛋白激酶，并且在细胞和分子水平阐明其发挥作用的机制，从而找到Cx31 GJIC动态调节的线索。 3.研究方法 为了考察PKA和PKC对Cx31的GJIC的调节作用，我们以稳定表达Cx31/myc的Hela细胞为细胞模型，在PKA和PKC激活剂、抑制剂处理细胞后，通过检测细胞间染料转移程度评价Cx3l GJIC水平。为了分析PKA和PKC调节Cx31 GJIC的机制，我们通过免疫荧光染色计数细胞间间隙连接斑以间接评价Cx31通道数量；通过Western Blot考察细胞内Cx31稳态水平以分析Cx31合成和降解的变化；通过阻断蛋白质运输不同阶段以分析Cx31运输的改变。 4.实验结果 我们发现，激活PKA 3个小时以后，Cx31通道的染料转移水平相比对照组提高2倍以上，而激活PKC 3个小时以后Cx31通道的染料转移水平降低到对照组的13％。在PKA激活3个小时以后，细胞之间可以通过荧光显微镜观察到的间隙连接斑数量增加了.45％，同时间隙连接斑的长度也有增加。PKC激活对间隙连接斑没有显著影响。无论是PKA还是PKC激活，细胞内Cx31水平都没有显著变化。进一步对Cx31细胞内运输的分析表明，阻断内质网高尔基体之间的运输或者破坏tubulin细胞骨架结构并不影响PKA对Cx31运输的促进作用，而破坏actin细胞骨架结构会显著抑制PICA的作用。 5．结论 以上结果表明，PKA激活3小时后，细胞内Cx31合成和降解没有显著变化；细胞内已经存在的位于高尔基体之后的Cx31向细胞膜上运输增加，或者组装成通道的过程加速，使细胞膜上的Cx31间隙连接通道的数量增加，从而导致细胞间染料转移水平增加；PKA的作用需要完整的actin细胞骨架结构。PKC激活3个小时后，细胞内Cx31合成、降解没有显著变化，细胞膜上Cx31通道的数量也没有显著变化，细胞间染料转移水平降低可能与通道通透性降低有关。PKA和PKC激活3个小时后，并没有发现可以由SDS—PAGE分辨出的Cx31磷酸化状态改变。 我们以前的研究已经证明Cx31的合成、运输、组装和降解是动态的连续过程。通过本研究，我们发现，细胞内PKA和PKC可以调节动态的Cx31细胞内运输、在细胞膜上的组装以及通道的通透性从而上调或者下调Cx31 GJIC。