论文部分内容阅读
目的:探究杜鹃花总黄酮（Total flavones of Rhododendra simsii Planch,TFR）通过基质相互作用分子（Stromal interaction molecule,STIM）/钙释放激活钙通道调节分子（Calcium release-activated calcium channel modulator,Orai）调控的钙库操作性钙内流（Store-operated calcium entry,SOCE）对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠不同阶段脑组织的影响。方法:1.在体实验:运用大脑中动脉闭塞（Middle cerebral artery occlusion,MCAO）构建局灶性脑缺血再灌注损伤模型。将SD雄性大鼠随机分为13组,分别是假手术组（Sham）、MCAO组（1 d、3 d、14 d）、TFR组（1 d、3 d、14 d）、TFR+SOCE抑制剂2-氨基乙基联苯基硼酸酯（2-Aminoethoxydiphenyl borate,2APB）组（1 d、3 d、14 d）、2APB组（1 d、3 d、14 d）,每组各8只。除Sham组,其余各组建立MCAO模型。除Sham、MCAO组大鼠给予生理盐水（Normal saline,NS）外,1 d组TFR（100 mg/kg）采用尾静脉注射给药,3 d、14 d组均灌胃给予TFR（60 mg/kg）直至取材,SOCE通道抑制剂组术后腹腔注射2APB（2.5mg/kg）。ELISA检测血清中炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α的活性;HE染色检测大鼠缺血脑组织的病理变化;TTC染色检测大鼠脑组织梗死的情况;Western blot和RT-q PCR分别检测各时段脑组织STIM1、STIM2、Orai1、Caspase-3、PKB的蛋白及mRNA表达水平;免疫荧光检测慢性恢复期14 d时各组大鼠脑神经元的生长情况。2.离体实验:体外培养PC12细胞,检测急性期细胞水平变化,随机分为5组,分为正常组（Normal）、缺氧复氧组（Model）、TFR组（0.3 mg/m L）、TFR+2APB组（0.3 mg/m L+22.51 mg/m L）、2APB组（22.51 mg/m L）。采用CCK-8检测TFR不同浓度下的细胞活力;采用激光共聚焦技术检测TFR及SOCE信号通路阻断剂对缺氧复氧PC12细胞Ca2+浓度的变化;运用流式细胞仪检测TFR及SOCE信号通路抑制剂对缺氧复氧PC12细胞凋亡的影响。结果:1.在体实验:（1）与Sham组相比,MCAO大鼠的神经功能在各个时段的评分均显著增加（P<0.01）;与同时段MCAO组相比,TFR能够明显降低各个时间段大鼠的神经功能评分（P<0.05）,1 d、3 d加入阻断剂2APB后,大鼠神经功能评分进一步降低（P<0.01）。而14 d时,TFR+2APB组神经功能评分明显高于TFR组（P<0.05）。（2）ELISA检测法结果显示,各时间点的MCAO大鼠血清中的IL-1、IL-6、TNF-α含量均显著高于Sham组（P<0.01）;与同时段MCAO组相比,各时间段TFR组IL-1、IL-6、TNF-α含量均显著下降（P<0.05,P<0.01）;与同时段TFR组相比,1 d、3 d TFR+2APB组IL-1、IL-6、TNF-α的含量均明显降低（P<0.05）,而14 d组以上指标均显著高于TFR组（P<0.05）;与同时段2APB组比较,各时间段TFR+2APB组IL-1、IL-6、TNF-α含量均明显降低（P<0.05,P<0.01）。（3）HE染色结果显示,Sham组细胞排列规则,核仁清晰,而不同时段的MCAO组形态均不规则,表现为细胞结构紊乱、空泡形成、细胞坏死。与同时段MCAO组相比,各时间点TFR组大鼠梗死侧脑组织细胞坏死明显减少,加入抑制剂2APB后,1 d、3 d脑损伤程度进一步显著降低,但14 d组脑损伤加重。TTC染色法结果显示,各时间段MCAO组出现明显脑梗死灶。与同时段MCAO组相比,各时间点TFR组大鼠脑梗死灶明显减少,脑梗死率明显降低（P<0.01）,尤其是14 d TFR组效果最明显;与同时段TFR组相比,1 d、3 d TFR+2APB组脑梗死面积显著减少,脑梗死率显著降低（P<0.01）,而14 d组则明显增大（P<0.01）;与同时段2APB组相比,各时间段TFR+2APB组脑梗死率均显著降低（P<0.05）。（4）Western blot和RT-q PCR结果显示,与Sham组相比,1 d、3 d MCAO大鼠脑组织中STIM1、STIM2、Orai1、Caspase-3的蛋白及mRNA表达水平显著升高（P<0.05）,PKB蛋白及mRNA表达明显降低（P<0.01）,而14 d MCAO组STIM1、STIM2、Orai1、PKB蛋白及mRNA表达显著降低（P<0.05）,Caspase-3蛋白及mRNA表达水平显著升高（P<0.01）;与同时段MCAO组相比,1 d、3 d TFR组大鼠脑组织中STIM1、STIM2、Orai1、Caspase-3蛋白及mRNA表达显著降低（P<0.05）,PKB蛋白及mRNA表达升高（P<0.05）。而连续用药TFR 14 d后,相较于MCAO组,TFR组STIM1、STIM2、Orai1、PKB蛋白及mRNA表达升高（P<0.05）,Caspase-3蛋白及mRNA表达显著降低（P<0.01）;与同时段TFR组或2APB组相比,1 d、3 d TFR+2APB组STIM1、STIM2、Orai1、Caspase-3蛋白及mRNA表达明显下降（P<0.05）,PKB蛋白及mRNA表达升高（P<0.05）;14 d时,TFR+2APB组STIM1、STIM2、Orai1、PKB的蛋白及mRNA表达显著低于TFR组,但高于2APB组（P<0.05）,Caspase-3蛋白及mRNA表达高于TFR组（P<0.05）,低于2APB组（P<0.05）。（5）免疫荧光结果显示,14 d Sham组、MCAO组与2APB组并未见Brdu/MAP-2双标阳性细胞,14 d TFR组可见少量Brdu/MAP-2双标阳性细胞表达,而加入SOCE信号通路阻断剂2APB后Brdu/MAP-2双标阳性细胞表达减少。2.离体实验:（6）CCK-8结果显示,当TFR浓度大于1.05 mg/m L时,细胞存活率显著下降（P<0.01）;（7）激光共聚焦检测结果显示,PC12细胞经缺氧复氧处理后其Ca2+荧光强度较Normal组明显增高（P<0.01）;用药TFR后,Ca2+荧光强度较Model组明显降低（P<0.05）;与TFR组或2APB组相比,TFR+2APB组Ca2+荧光强度明显降低（P<0.01）。（8）Model组与Normal组相比,PC12细胞的凋亡率显著增高（P<0.01）;与Model组相比,TFR组PC12细胞凋亡率明显降低（P<0.01）;与TFR组或2APB组相比,TFR+2APB组PC12细胞凋亡率显著降低（P<0.05）。结论:TFR具有改善MCAO大鼠脑组织损伤的作用,其机制可能与其调控缺血再灌注不同时期的SOCE通路活性有关。在发生缺血性脑卒中时,急性期TFR可能通过抑制SOCE通路活化,减少炎症因子表达,保护受损的脑组织损伤;后期TFR可能通过促进SOCE通道基因表达,上调其活性,促进缺血区周边的神经发生,减少神经元凋亡,从而发挥改善脑损伤的保护作用。