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背景:软骨终板(Cartilage endplate,CEP)退变后导致的椎间盘中代谢物和营养物质的转运障碍,是椎间盘退变的重要始动因素之一。软骨终板的早期退变(ModicⅠ型)涉及软骨终板和软骨下骨的微骨折以及邻近的骨髓水肿。在炎症和生理因素的刺激下,软骨终板退变进一步加重并最终发展为ModicⅢ型,即软骨终板和软骨下骨的钙化。钙化的软骨终板阻碍了营养物质和代谢产物在椎间盘内外的运输,最终导致或加重椎间盘的退变。软骨终板退变可导致软骨终板干细胞(Cartilage endplate stem cells,CESCs)的老化,细胞表型和分化功能丧失,细胞外基质降解,最终引起椎间盘的退变。然而,炎症反应诱导的软骨终板退变的机制仍不清楚。自噬功能不足被认为在椎间盘退变的发展中起着重要作用。肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis factor alpha,TNF-α)和白细胞介素-1β(IL1-β)等炎症因子在发生Modic改变时,在软骨终板中高度表达。核因子-红细胞-2相关因子2(Nrf2)/Kelch样ECH相关蛋白1(Keap1)通路可通过控制抗氧化蛋白的表达在细胞对氧化应激的抗性中起调节作用。在活性氧或炎性因子刺激下,Nrf2/Keap1复合物被破坏,并且新合成的Nrf2转位至细胞核并激活抗氧化蛋白的转录进而调控细胞对炎症的应答。因此,我们推测在软骨终板衰老期间,CESCs细胞Nrf2和基础自噬水平均降低,导致其更易受炎症和其他生理刺激因素影响。通过研究自噬和Nrf2/Keap1信号传导的作用及两者关系,将有助于阐明软骨终板退变的机制为软骨终板退变的预防和治疗提供线索。方法:第1部分:小鼠软骨终板退变模型的建立及自噬抑制/诱导对终板退变的影响在尾椎软骨终板下1mm处进行剪断椎体,之后每3天腹腔注射氯喹(Chloroquine,CQ)和雷帕霉素(Rapamycin,Rap),持续30天。最后分离尾椎,切片进行组织学和免疫组织化学分析。第2部分:自噬在炎症因子TNF-α所致CESCs损伤中的机制研究从小鼠软骨终板中分离CESCs,并通过流式细胞术和成骨、成脂、成软骨分化对其进行干细胞相关特性鉴定。用TNF-α处理CESCs,并用氯喹抑制自噬或雷帕霉素激活自噬。通过衰老相关的β-半乳糖苷酶(Senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-gal)染色来检测细胞衰老,并通过流式细胞术和Western-Blot检测细胞内活性氧和抗氧化蛋白。通过免疫组织化学染色,PCR和Western-Blot检测基质金属蛋白酶的表达。通过PCR,Western-Blot和三系分化来研究CESCs分化潜能的改变。第3部分:自噬通过增强CESCs中Nrf2/Keap1信号通路来抑制炎症所致的软骨终板损伤的机制研究。用免疫组化、免疫荧光染色,PCR和Western-Blot检测TNF-α处理下,联合自噬抑制剂氯喹或诱导剂雷帕霉素后Nrf2的表达。为了研究自噬与Nrf2/Keap1信号通路的关系,使用慢病毒过表达Nrf2。结果:第1部分:1.小鼠尾椎终板下骨折后炎症介质TNF-α表达增加而自噬相关因子LC3表达则下降。2.氯喹抑制自噬加重骨折后软骨终板的退变,而雷帕霉素激活自噬则对软骨终板起保护性作用。第2部分:1.从小鼠软骨终板分离出来的CESCs具有间充质干细胞样特征。2.TNF-α处理后CESCs自噬增加,而自噬可以被氯喹抑制或被雷帕霉素激活。3.在TNF-α处理后,CESCs的氧化应激升高、细胞衰老增多;抑制自噬加重这些改变,激活自噬则减轻这些改变。4.在TNF-α处理后,CESCs中基质金属蛋白酶MMP13和ADAMTS5表达升高;自噬被抑制时其表达升高,而激活自噬则降低其表达。5.在TNF-α处理后,CESCs中成骨相关基因Runx2和ColⅠ的表达增加,细胞向成骨分化,成软骨相关基因Sox9和ColⅡ表达下降,成软骨分化受到抑制;抑制自噬加重这些改变,激活自噬则减轻这些改变。第3部分:1.TNF-α处理后,激活自噬促进CESCs中Nrf2的表达并抑制Keap1的表达,而当自噬被抑制时,作用则相反。2.激活自噬促进Nrf2进入细胞核,从而增强下游抗氧化蛋白表达的表达。3.Nrf2过表达减轻TNF-α所致CESCs损伤,自噬被抑制时其作用被削弱。结论:我们在成功构建小鼠软骨终板退变模型的基础上发现细胞自噬功能可以保护软骨终板细胞免受慢性炎症所致的损伤,其作用是通过促进抗氧化蛋白表达,清除活性氧,减少细胞衰老和维持CESCs的分化潜能来实现的。自噬与Nrf2/Keap1信号传导之间的关系密切,自噬抑制或激活可影响Nrf2的表达和核转位,进而通过调控抗氧化蛋白的表达来影响炎症所致软骨终板的退变。