研究背景：胃癌(Gastric cancer,GC)是一种具有高度侵袭性和致命性的恶性肿瘤，大部分患者就诊时已处于进展期。尽管由于现代诊疗技术的进步和先进的开放以及腹腔镜微创技术的发展，手术切除的效果越来越好，但是由于它们的高度侵袭性，复发和转移成为导致胃癌患者死亡的最主要原因。许多信号途径在肿瘤的侵袭和转移机制中发挥着作用，最近的证据表明，SHH信号通路的异常活化是多种高侵袭性恶性肿瘤的共同特征。因此推测，特异性抑制活化的SHH信号通路成为一种新的有可能的治疗措施。SHH信号通路在胃癌侵袭转移中的作用及其分子机制，以及阻断SHH信号通路是否能有效的抑制胃癌细胞的生长、侵袭和转移尚不清楚。目的：探讨SHH信号通路在胃癌发生发展、侵袭转移过程中的作用及其可能机制，为胃癌的诊治提供新的思路和理论依据。方法：1.收集胃癌组织和正常胃黏膜组织标本。2.运用免疫组化染色法检测观察Shh、Ptch1、Gli1蛋白的表达，并将结果与临床病理资料参数进行统计学分析。3. Western blot法检测Shh、Ptch1、Gli1蛋白在七种胃癌细胞系(MNK-45、SGC-7901、MNK-28、BGC-823、MGC-803、AGS、HGC-27)中的表达。4.选择SHH信号通路分子Shh、Ptch1、Gli1蛋白表达最强的低分化胃黏液腺癌MGC-803做为后序实验用细胞。使用不同浓度的cyclopamine(2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L)处理细胞，运用MTT法检测细胞增殖能力的变化，流式细胞仪检测细胞DNA合成和细胞周期的变化。5.倒置显微镜镜下观察细胞形态的变化，TUNEL法原位检测细胞凋亡情况。6.划痕愈合实验、Transwell小室实验检测细胞侵袭与运动能力的改变。7. Western blot法检测Ptch1、Gli1、P21、Bcl2、E-cad等蛋白的表达。8.裸鼠皮下和腹腔移植瘤实验观察细胞侵袭转移能力的变化。结果：1.113例胃癌组织和60例正常胃黏膜组织病理切片，切片完整，厚薄均匀，核浆染色分明，红蓝适度。2.胃癌组织中SHH信号通路三种蛋白Shh、Ptch1和Gli1的表达较正常胃黏膜组织明显增高，蛋白在胃癌组织和正常胃黏膜组织中的阳性率分别为71.68%(81/113)，84.96%(96/113)，80.53%(91/113)；31.67%(19/60)，28.33%(17/60)，20.00%(12/60)。Spearman相关性分析表明，胃癌组织中Shh、Ptch1、Gli1的蛋白表达水平呈现显著的正相关。Shh、Ptch1和Gli1蛋白表达在肿瘤分化程度、不同浸润深度、不同病理分期和有无淋巴结转移组内表达率的差异性有统计学意义，而在年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位、大体分型组内差异无统计学意义。Shh阳性表达组与阴性表达组间的总体生存率与无病生存率均无统计学意义，后退法多元Cox回归分析发现Shh蛋白是胃癌患者总体生存率差的一个独立预后因子。3.在七种胃癌细胞系中，SHH信号通路的关键组成成分Shh、Ptch1、Gli1蛋白均有不同程度的表达。Shh在BGC-823、MGC-803、AGS和SGC-7901中高表达，MNK-28中阳性表达，但较前四者相比稍弱，MNK-45弱于MNK-28，HGC-27中表达非常弱。Ptch1在BGC-823、HGC-27、MGC-803细胞中表达强度最高，AGS和SGC-7901细胞中也呈阳性表达，MNK-45和MNK-28细胞表达稍弱。Gli1在七种胃癌细胞系中均有表达，但表达强度明显弱于Shh和Ptch1，其中MNK-45、MGC-803、AGS、MNK-28细胞中表达强度最高，BGC-823、HGC-27、SGC-7901表达强度稍弱。4.应用SHH信号通路特异性阻断剂cyclopamine干预处理人胃癌细胞系MGC-803后， Ptch1和Gli1蛋白的表达显著下降， Western blot检测发现随着cyclopamine浓度的增加(2μM→5μM→10μM)，呈现一定的剂量依赖性。SHH信号通路阻断剂可以达到显著抑制胃癌MGC-803细胞生长增殖的作用，而且与时间和剂量呈正相关。MTT结果显示同一药物浓度干预处理，生长曲线增长随着时间的延长而减缓；而在同一作用时间点上，药物浓度越大，生长增殖越慢。流式细胞仪器检测结果提示，cyclopamine干预处理能显著减少胃癌细胞DNA的合成，细胞周期G0/G1比例明显增多而S期细胞数目明显减少。Western blot检测发现细胞周期调节蛋白抑制因子P21表达显著升高。5.阻断SHH信号通路后，细胞形态由细长变圆、变钝，细胞体积缩小，细胞核固缩，贴壁细胞脱落、悬浮。TUNEL法检测发现干预处理后细胞胞浆减少，体积缩小，核固缩、碎裂增多，荧光显微镜下反光增强，凋亡率明显增加。Western blot检测发现抗凋亡基因bcl-2表达下调。6. cyclopamine干预后胃癌细胞侵袭运动能力明显受抑制。划痕愈合实验结果发现实验组细胞愈合能力减弱，Transwell小室实验发现胃癌细胞体外迁移运动和侵袭能力均降低，抑制率分别为77.1±16.2%和80.3±15.3%。Western blot检测发现cyclopamine干预处理阻断SHH信号通路后，E-cadherin蛋白表达量显著上升。7.动物实验表明，裸鼠皮下移植瘤模型实验组与对照组相比较肿瘤生长速度慢，肿瘤体积小。免疫组化结果显示，裸鼠皮下移植瘤实验组Shh，Ptch1和Gli1蛋白表达分别为阴性、阳性、阴性；而对照组Shh，Ptch1和Gli1蛋白表达分别为阳性、强阳性、弱阳性。裸鼠腹腔移植瘤实验组腹腔内成瘤数、肿瘤最大径和肿瘤总重量均少于对照组。结论SHH信号通路在胃癌组织中表达异常升高，与肿瘤分化程度、浸润深度、临床分期、淋巴结转移相关。Shh蛋白是胃癌恶性度高、预后差的预测因子，提供了对胃癌预后的判断，提示SHH是胃癌的一个关键作用点，表明SHH应该是胃癌基因层面治疗的一个新的目标靶点。侵袭性强且恶性程度高的MGC-803细胞系中SHH信号通路活性最强。阻断SHH信号通路，能显著抑制细胞DNA合成，阻滞细胞周期进展，有效抑制细胞增殖，其机制可能与p21蛋白的上调相关。阻断SHH信号通路，胃癌细胞生存能力下降，凋亡增加，机制可能与抗凋亡基因Bcl-2的抑制有关。阻断SHH信号通路，有效抑制胃癌细胞的侵袭、迁移和运动能力，机制可能与E-cad蛋白的上调相关。表明SHH信号通路与胃癌发生发展、侵袭转移密切相关，阻断SHH信号通路后，p21、Bcl-2和E-cad蛋白的表达发生变化，表明SHH信号通路可能机制与p21、Bcl-2和E-cad蛋白相关。动物实验也发现：阻断SHH信号通路后，裸鼠皮下移植瘤生长速度慢，肿瘤体积小。裸鼠腹腔移植瘤成瘤数目少，肿瘤最大径小，肿瘤总重量小。表明抑制SHH信号通路同样能够阻止体内胃癌细胞的发生发展、侵袭转移，亦提示SHH信号通路在体内胃癌侵袭转移中发挥了重大作用。本研究发现SHH信号通路的异常活化可以作为胃癌恶性程度高的特征之一，SHH信号通路参与了胃癌的发生发展、抗凋亡、侵袭转移的调控。提示SHH是胃癌侵袭转移的一个重要信号通路，为进一步深化胃癌的机理研究和靶向治疗提供了一个新的思路。