明绿豆中PAL、SOD的研究及L-SOD的制备

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明光绿豆以其色泽晶莹碧绿,粒大皮薄、汤清易烂,清香可口等特点,质量为全国之冠,被称为“明绿”,曾经被作为贡品。2008年明光绿豆被列为“国家地理标志保护产品”[1]。我国对绿豆的研究长期以来都主要集中种植上,对其基础特性、功能特性、综合利用及深度开发缺乏系统深入的研究,采用高新技术对原料进行深度开发的成果也尚不多见。本文以明光绿豆为原料,对其基本成分进行了测定;通过采用饱和硫酸铵分级沉淀、透析脱盐、DE-52阴离子交换层析等步骤对苯丙氨酸解氨酶(PAL)进行分离纯化,并对其基本酶学性质和金属离子及氨基酸等外界因子的影响进行初步的探索;利用Plackett-Burman设计及响应面法优化超声辅助提取明绿豆超氧化物歧化酶(SOD),通过采用饱和硫酸铵分级沉淀、透析脱盐、Sephadex G-75分子筛层析等步骤对SOD进行分离纯化并初步探究了SOD的基本酶学性质;同时,响应面优化了SOD脂质体的制备工艺,并初步研究了脂质体包封后SOD的稳定性等。为明绿豆的综合利用以及其功能性成分的进一步开发与利用提供了理论依据。主要研究结果如下:1.明绿豆基本成分测定结果如下:(1)明绿豆基本成分含量:水分为11.82%,粗淀粉为53.25%,粗蛋白为25.26%,粗脂肪为0.90%,灰分为3.70%;(2)明绿豆中必需氨基酸含量:缬氨酸为22.57 mg/g,苏氨酸16.63 mg/g,蛋氨酸5.94 mg/g,异亮氨酸18.21 mg/g,亮氨酸38.00 mg/g,苯丙氨酸28.50 mg/g,赖氨酸35.23 mg/g;苏氨酸为明绿豆的第1限制氨基酸;(3)明绿豆中矿物质含量:Ca 47.76 mg/kg,Cu 0.54 mg/kg,Fe 1.94 mg/kg,Zn 2.09mg/kg,K 576.69 mg/kg,Mn 0.79 mg/kg;2.明绿豆PAL最佳分离纯化条件为:PAL洗脱液pH值为8.8,最佳离子强度为0.4 mol/L氯化钠。PAL的纯化倍数为6.982 9,蛋白质得率为4.65%,酶得率为32.45%。3.明绿豆PAL基本性质的研究:(1)PAL在硼砂-硼酸缓冲溶液中适宜的pH范围为7.69.0,最适pH有2个:8.0和8.6。(2)PAL最适温度范围为3545℃,最适反应温度为40℃。超过70℃则被钝化。(3)得到PAL的两个Km值,分别是:Km1为6.94×10-5 mol/L,Km2为1.23×10-4mol/L。经SDS-PAGE鉴定为两条蛋白质区带,其亚基分子量分别为52 KD,57 KD。(4)L-酪氨酸、L-半胱氨酸、组氨酸和肉桂酸对PAL活性都有抑制作用,抑制程度随抑制剂不同而不同。L-胱氨酸对PAL的活性无影响。4.明绿豆SOD最佳提取条件:采用液固比22(mL/g)、磷酸盐缓冲液pH 7、超声功率140 W、超声时间20 min,超声水浴温度44℃、水浴浸提时间1.5 h、水浴浸提温度60℃的组合,明绿豆SOD的实际比活力为856.95 U/mg。5.明绿豆SOD的分离纯化:SOD的最佳盐溶条件为35%硫酸铵,最佳盐析条件为85%硫酸铵;经过一系列分离纯化,明绿豆SOD的纯化倍数为29.93,蛋白质得率为4.65%,酶得率为46.62%。6.明绿豆SOD的基本性质:明绿豆SOD对酸具有一定的稳定性,最适pH范围为68;明绿豆SOD具有一定的热稳定性,最适温度范围为4060℃,最适温度为60℃。7.明绿豆SOD脂质体最佳制备工艺参数:脂胆比2.1(mL/g)、类脂浓度为21mg/L、有机相与水相体积比为4.1(mL/mL)。在此最优条件下SOD脂质体包封率达88.73%。8.SOD脂质体(L-SOD)稳定性研究:累积释放12 h时,SOD的释放度为77%;24 h时,SOD的释放度为95%。80℃水浴恒温150 min L-SOD的相对活力为90%,游离的SOD仅为2%。经胃蛋白酶在37℃作用10 min后,游离SOD的活性残留5.2%,L-SOD活性残留72.6%。
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