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目的：本实验通过shRNA对NK细胞KIR2DL3基因进行表达沉默,研究NK细胞体外抑制HCV复制活性与KIR2DL3基因的关系,并对其作用机制进行初步探讨,以期为HCV的感染机制认识及免疫治疗提供新思路。方法：首先,设计针对KIR2DL3基因mRNA的shRNA,通过梯度降温合成shRNA双链,并利用shRNA两侧的粘性末端与线性PLK0.1载体的粘性末端互补结合而将shRNA片段插入PLK0.1载体中,并通过脂质体转染方法将表达载体与PSPAX2、PMD2G两种辅助质粒共转染到293T细胞,获得慢病毒,用慢病毒感染NK细胞,实现NK细胞KIR2DL3基因表达的沉默,并用western-blot检测NK细胞KIR2DL3的沉默效率。之后我们利用pFL-J6/JFH-1质粒转录出HCV-RNA,纯化HCV-RNA,通过脂质体转染法将HCV-RNA与Huh7.5.1细胞转染,收集HCV病毒颗粒。然后利用磁珠分选技术分选健康人CD4+T细胞,利用HCV病毒颗粒感染人CD4+T细胞,制备HCV体外培养方法,RT-PCR检测CD4+T细胞的HCV表达。提取6例携带KIR2DL3基因,并且HCV抗原抗体阴性受试者的NK细胞及CD4+T细胞,将沉默KIR2DL3基因的NK细胞、未沉默KIR2DL3基因的NK细胞分别与感染HCV的自体CD4+T细胞(HCV-CD4+T细胞)共同孵育24小时,RT-qPCR检测CD4+T细胞内HCV-RNA相对含量。结果：本实验可以包装出稳定的针对KIR2DL3基因的具有感染性的慢病毒。NK细胞感染慢病毒后,KIR2DL3表达水平明显降低,沉默效率约80%。利用脂质体转染方法通过Huh-7.5.1细胞可成功制备出HCV体外培养系统,产生稳定的HCV病毒颗粒,可成功感染人CD4+T细胞。与未沉默KIR2DL3基因的NK细胞相比,沉默KIR2DL3基因后的NK细胞与CD4+T细胞共同孵育后,CD4+T细胞HCV相对含量减少更明显,提示沉默KIR2DL3基因后的NK细胞具有更强的杀伤活性。结论：通过shRNA可以成功实现NK细胞KIR2DL3基因沉默。通过NK细胞KIR2DL3基因沉默前后对HCV-CD4+T细胞中HCV相对含量影响的对比,可初步判断,沉默KIR2DL3基因的NK细胞具有更强的HCV清除趋势。