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生物反应器搭建了现代动物生物技术与药用蛋白表达制药技术的桥梁,是现代生物技术领域的研究热点,应用生物反应器来制备口服疫苗的研究,国内外鲜有报道。本研究针对人畜共患轮状病毒病,设计了口服铁蛋白纳米疫苗生物反应器,并通过小鼠模型,对其免疫原性与保护能力进行了初步的验证。研究结果如下:1、人轮状病毒VP6蛋白及铁蛋白Ferritin的原核表达及功能研究通过NCBI数据库获取人轮状病毒VP6基因和铁蛋白(Helicobacter pylor/non-haem iron-containing ferritin)的核苷酸序列,并克隆到pET-32a载体上。之后使用大肠杆菌表达系统表达得到了 rferritin,rVP6以及rVP6-ferritin融合蛋白,并对三种蛋白的IPTG诱导浓度、诱导时间和起始诱导菌液浓度(OD600)等表达条件进行了优化探索。通过Ni2+亲和层析及分子筛等方法纯化得到了 ferritin,rVP6和rVP6-ferritin蛋白。使用透射电子显微镜观察复性后的ferritin蛋白和VP6-ferritin可见两种蛋白可以形成相似的纳米颗粒,粒径均一。使用纯化得到的重组蛋白对小鼠进行灌胃免疫可以诱导小鼠产生anti-VP6特异性的IgG和IgA抗体,且使用rVP6-ferritin蛋白对小鼠进行灌胃免疫可以显著提高小鼠的体液免疫和粘膜免疫应答,与添加免疫佐剂效果相当。2、rVP6-Ferritin重组蛋白乳腺特异性表达载体的构建及功能检测对轮状病毒VP6基因和铁蛋白ferritin基因序列按哺乳动物偏好性密码子进行了优化和合成,并定向克隆入乳腺特异性表达载体pBC1中。将pBC1-rVP6-ferritin-EGFP-IRES-Neo载体用核转染仪转染乳腺癌细胞系Bcap-37细胞,转染24h后在荧光显微镜下可以观察到绿色荧光蛋白GFP的表达,RT-PCR检测到GFP和rVP6-ferritin基因mRNA的表达,Western-blot成功检测到60 kDa的rVP6-ferritin蛋白条带。3、轮状病毒VP6-ferritin纳米疫苗乳腺生物反应器小鼠模型的制备与检测使用显微注射仪注射到小鼠的受精卵中,并将受精卵移植入受体小鼠。结果显示,共有5只founder小鼠(3只雌性和2只雄性)整合了 rVP6-ferritin基因,rVP6-ferritin基因在可以在转基因雌性小鼠的乳腺中表达,且该表达仅限于哺乳期转基因小鼠的乳腺中。乳汁中外源蛋白的浓度为52.04 mg/L到125.25mg/L。对小鼠的血清IgG及小肠粘膜IgA抗体检测,结果显示通过转基因阳性小鼠母乳获得的rVP6-ferritin蛋白可以成功诱导小鼠产生血清免疫和粘膜免疫。使用200倍TCID50浓度的SA-11轮状病毒对5日龄的乳鼠进行攻毒试验结果显示,转基因母鼠喂养的小鼠在攻毒后只有部分发生轻度的腹泻症状,且很快恢复健康,而野生型母鼠喂养的小鼠在攻毒后都发生了重度腹泻症状,且持续了 5天以上,并造成一只小鼠死亡。其余小鼠虽然在第8天恢复健康,但其生长发育状况受到了严重干扰,身体消瘦,体重显著偏低。4、利用转基因水稻生产轮状病毒纳米疫苗的初步研究通过将rVP6-ferritin基因序列按照水稻偏好性密码子进行优化,并构建了一个水稻过表达rVP6-ferritin基因载体和两个水稻胚乳特异性表达rVP6-ferritin基因载体。成功获得了三个转基因水稻品系,并使用RT-PCR和Western blot试验检测到rVP6-ferritin基因的mRNA的转录和蛋白的表达。由于在后续扩大种植试验中水稻出现了外源蛋白表达量降低和外源基因沉默的现象,对水稻中表达的rVP6-ferritin蛋白的功能还需要进一步研究。结论:原核表达获得的重组蛋白rVP6-ferritin具有与rVP6相似的抗原性,并可以在细胞外自组装为与ferritin类似的均一球形纳米粒子。使用纯化的rVP6-ferritin重组蛋白对小鼠进行灌胃免疫可以诱导小鼠产生anti-VP6特异性的血清IgG和小肠粘膜IgA抗体,且rVP6-ferritin蛋白诱导产生的anti-VP6特异性血清IgG和小肠粘膜IgA抗体滴度显著高于rVP6蛋白。转染乳腺特异性表达载体pBCl-rVP6-ferritin可以在Bcap37细胞中表达具有VP6抗原性的rVP6-ferritin蛋白。在转pBCl-rVP6-ferritin基因小鼠的乳腺中可以特异性表达及分泌rVP6-ferritin蛋白。小鼠直接饮用该乳汁可以诱导小鼠产生anti-VP6特异性的血清IgG和小肠粘膜IgA抗体,并可以保护5日龄的乳鼠免于轮状病毒感染或减轻感染症状。转基因水稻可以应用于rVP6-ferritin蛋白的表达,但所表达蛋白的功能还需要进一步研究。利用转基因水稻生产可食用疫苗具有巨大的潜力,但其具体应用还需要进行更多的研究和改进。