目的：常见的癌症类型如乳腺癌、肺癌和前列腺癌往往会在骨骼如股骨、胫骨、肋骨和椎骨中形成骨骼转移。骨骼中的肿瘤形成经常导致贫血，骨折风险增加，易感染，并且在许多情况下导致严重的疼痛状态，从而损害患者的生活质量。骨癌引起的疼痛是一种复杂的疼痛状态，会引起持续性疼痛、运动引起的疼痛和严重的突发性疼痛发作，并难以控制。虽然近年来关于骨癌痛的治疗已经取得了进展，但目前治疗方法仍然不足，这可能部分归因于对骨癌痛的机制了解不足。众所周知，趋化因子与神经病理性疼痛的发病机制显着相关，而最近几年趋化因子与骨癌痛之间的关系越来越受到大家的重视。　　越来越多的研究证实趋化因子可以促进肿瘤转移，抑制这些趋化因子显示出抗肿瘤活性。趋化因子在骨转移状态中表达水平上调，趋化因子调节肿瘤转移，决定肿瘤微环境中癌症的发展。目前已经被证实多中趋化因子及其受体（如CXCL12/CXCR4,CXCL1/CXCR2,CCL2/CCR2,CCL5/CCR5,CX3CL1/CX3CR1和CXCL10/CXCR3）参与骨癌痛发生发展的过程。　　趋化因子CXCL13可以有效趋化B细胞，因此又称B细胞趋化因子，最初在B细胞滤泡中的基质细胞中发现，调节B细胞和T细胞亚群归巢。生理状态下CXCL13在中枢神经系统是不表达的，而在病理状态下如：神经软化、自体免疫脱髓鞘和原发性中枢神经系统淋巴瘤等，大脑和脊髓中CXCL13表达上调。模拟自身免疫性脑脊髓炎的小鼠实验中，在炎性脑膜和脊髓中的浸润性树突状细胞中发现了CXCL13。CXCR5作为CXCL13的唯一受体，表达于所有的淋巴细胞、血液中T细胞亚组、淋巴组织和脑脊液中。研究证明：在脑组织和脑脊液中CXCL13水平与脑脊液中B细胞的数量直接相关。多发性硬化治疗成功往往伴随着脑脊液中CXCL13和B细胞数量下降。然而有报道称CXCL13缺乏的动物，表现为正常的B细胞招募，轻度自限性的实验性免疫性脑炎。表明了在中枢神经系统中CXCL13/CXCR5调节神经性炎症并不依赖B细胞机制。在神经病理疼痛的模型中，研究发现CXCL13和CXCR5在正常的大鼠和人类中表达量很少，神经病痛建模后10天，CXCL13表达量增加47倍之多，远远超过CCL7、CCL2、和CXCL1等其他趋化因子，其唯一受体CXCR5表达量也迅速上调，CXCL13/CXCR5信号通路在神经病理性疼痛中发挥重要的作用。然而脊髓CXCL13/CXCR5信号通路能否在骨癌痛发挥作用仍需进一步研究。　　本研究首先将探讨脊髓CXCL13/CXCR5在大鼠骨癌痛发生与发展中的作用，并进一步研究CXCL13/CXCR5介导大鼠骨癌痛发生发展的分子机制，为治疗骨癌痛提供新的靶点与思路。　　方法:1脊髓CXCL13/CXCR5信号通路在大鼠骨癌痛发生与维持中的作用　　建立大鼠骨癌痛模型，利用Western Blot技术分别检测接种肿瘤细胞后7、14、21d时大鼠L4-5段脊髓背角CXCL13和CXCR5表达水平。通过鞘内注射CXCL13重组蛋白(rrCXCL13)观察CXCL13过表达对正常大鼠痛行为学的影响。通过连续鞘内注射CXCL13中和抗体(接种后1d开始，1次/d，连续注射14d)，测试接种后1、3、5、7、10和14d时机械撤足反应阈(PWT)，验证CXCL13在大鼠骨癌痛发生中的作用。通过预先鞘内注射CXCR5siRNA(接种前4d开始，1次/d，连续注射3d)，测试接种前1d、接种后1、3、7、14d时PWT，验证脊髓CXCR5在大鼠骨癌痛发生中的作用。大鼠于接种后14d时单次鞘内注射CXCL13中和抗体，并于注药后30min、1h、2h、3h、4h时测定PWT，探讨脊髓CXCL13在大鼠骨癌痛维持中的作用。大鼠于接种后7d时连续鞘内注射CXCR5siRNA（1次/d，注射3d），并于接种后7、10、14和21d时测定PWT，探讨脊髓CXCR5在大鼠骨癌痛维持中的作用。　　2脊髓星形胶质细胞在CXCL13/CXCR5信号通路介导大鼠骨癌痛中的作用　　利用免疫荧光双染技术分别检测骨癌痛大鼠脊髓中CXCR5与神经元标记物NeuN、星形胶质细胞标记物GFAP和小胶质细胞OX-42的共定位，判断CXCR5在骨癌痛大鼠脊髓中的细胞定位情况。通过向骨癌痛大鼠接种肿瘤细胞后14d时鞘内注射CXCR5siRNA，利用RT-PCR技术检测大鼠脊髓GFAP mRNA表达水平。分别通过鞘内注射小胶质细胞抑制剂米诺环素或星形胶质细胞抑制剂LA-α-aminoadipate(L-α-AA)，观察其对CXCL13诱导的骨癌痛大鼠痛行为学的影响。　　3脊髓CXCL13/CXCR5通过激活星形胶质细胞中ERK信号通路介导大鼠骨癌痛的分子机制　　正常大鼠鞘内注射rrCXCL13后1h，利用Western blot技术观察脊髓中p-ERK表达水平。利用免疫荧光双染技术观察骨癌痛大鼠接种14d时脊髓中p-ERK与星形胶质细胞标记物GFAP共定位情况。利用Western Blot技术检测星形胶质细胞抑制剂L-α-AA对rrCXCL13诱导骨癌痛大鼠中晚期脊髓p-ERK表达水平的影响。利用RT-PCR技术和痛行为学测试分别观察ERK抑制剂U0126对rrCXCL13诱导骨癌痛大鼠中晚期脊髓星形胶质细胞激活及痛行为学的影响。　　结果：1脊髓CXCL13/CXCR5信号通路参与大鼠骨癌痛的发生与维持　　大鼠胫骨接种肿瘤细胞后引起双侧后足痛觉过敏及脊髓中CXCL13和CXCR5表达上调。痛行为学结果显示，与接种肿瘤细胞前1d时比较，骨癌痛大鼠接种后7d时双侧后足PWT开始降低，并持续至21d。Western Blot结果证实，与sham组比较，大鼠脊髓CXCL13和CXCR5于接种后7d时表达上调，并持续至21d。与na(i)ve组和saline组比较，正常大鼠鞘内注射rrCXCL13后15min时PWT开始降低，并持续至120min。鞘内注射CXCL13中和抗体或CXCR5siRNA可减轻大鼠骨癌痛发生和维持阶段痛觉过敏。　　2脊髓星形胶质细胞在CXCL13/CXCR5信号通路介导大鼠骨癌痛中的作用　　免疫荧光双染结果显示骨癌痛大鼠脊髓CXCR5与神经元标记物NeuN和星形胶质细胞标记物GFAP共定位，与小胶质细胞标记物OX-42不发生共定位。RT-PCR数据证实，与CIBP-vehicle组比较，鞘内注射CXCR5siRNA可使骨癌痛大鼠脊髓GFAP mRNA表达上调。鞘内注射小胶质细胞活化抑制剂米诺环素对rrCXCL13诱导的大鼠痛觉过敏行为没有影响。预先鞘内注射星形胶质细胞抑制剂L-α-AA可部分缓解rrCXCL13诱导的正常大鼠痛觉过敏。鞘内注射L-α-AA可缓解骨癌痛大鼠的疼痛行为，但不能缓解CXCL13重组蛋白在骨癌痛早期诱导的痛阈下降。鞘内注射L-α-AA不仅可缓解骨癌痛大鼠中晚期的疼痛行为，还可以缓解CXCL13重组蛋白在骨癌痛中晚期诱导的痛阈下降。　　3脊髓CXCL13/CXCR5通过激活星形胶质细胞中ERK信号通路介导大鼠骨癌痛的分子机制　　Western Blot数据显示，与Vehicle组比较，rrCXCL13组大鼠鞘内注射rrCXCL13后引起脊髓p-ERK表达上调，而CXCR5siRNA-rrCXCL13组预先鞘内注射CXCR5siRNA可抑制p-ERK表达上调。免疫荧光双染结果证实，骨癌痛大鼠中晚期脊髓中p-ERK与星形胶质细胞标记物GFAP共表达。Western Blot结果显示，与vehicle-rrCXCL13组比较，鞘内注射星形胶质细胞抑制剂L-α-AA可抑制CXCL13重组蛋白诱导骨癌痛大鼠中晚期时脊髓p-ERK表达上调。RT-PCR数据证实，与vehicle-rrCXCL13组比较，鞘内注射ERK抑制剂U0126可抑制CXCL13重组蛋白诱导骨癌痛大鼠中晚期时脊髓GFAP mRNA表达上调。行为学测试结果显示，鞘内注射U0126不仅可减轻CXCL13诱导的正常大鼠痛觉敏化，还可减轻骨癌痛大鼠中晚期痛觉过敏。　　结论：上述结果提示脊髓趋化因子CXCL13通过星形胶质细胞与特异性受体CXCR5结合，并激活星形胶质细胞中ERK信号通路介导大鼠骨癌痛的痛觉过敏。