近年来,痛风的发病率呈逐年上升的趋势,已成为困扰人类健康的常见代谢性疾病之一。痛风通常是由于嘌呤代谢紊乱或尿酸排泄异常而引发的晶体性关节疾病,而且往往伴随着高血压、糖尿病和尿酸性肾结石等相关疾病。痛风的反复发作不仅会对人们的生活质量造成直接影响,甚至会导致肾功能衰竭。黄嘌呤氧化酶（Xanthine oxidase,XOD）作为体内嘌呤分解代谢中关键性的酶,起着维持体内血液中尿酸平衡的重要作用,是治疗痛风药物的作用标靶。相比于临床用于治疗痛风的化学合成类药物,天然植物活性成分更为安全,且药理作用广泛,为研发治疗痛风药物提供了更多选择。因此,寻找高效低毒的XOD抑制剂并研究其作用机制具有十分重要的意义。然而,作为潜在的XOD抑制剂,黄酮类化合物易受光、温度、酸度等外界条件的影响,水溶性较差,稳定性不高,导致黄酮化合物生物利用度低,影响其临床应用价值,如何增强其稳定性、提高其生物利用度,也是黄酮类化合物应用进程中的一项研究内容。本论文采用多种现代光谱学方法并结合分子模拟技术,在人体生理酸度条件下（pH 7.4）,研究了高良姜素、槲皮素和杨梅素3种黄酮醇化合物对XOD活性的抑制作用及抑制动力学,探究了它们对XOD催化产生的超氧阴离子（O₂^-）的抗氧化作用方式,两者间的结合性质及黄酮醇化合物对XOD结构的影响,并在此基础上分析了黄酮醇化合物对XOD的抑制机理。尝试通过牛血清白蛋白纳米粒子对槲皮素分子进行包载,以期保护槲皮素的生物活性,改善槲皮素的生物利用性。本项研究将为深入认识其发挥药效的实质提供理论基础,对于新型XOD抑制剂开发与应用具有重要指导意义。本人的主要研究内容及结果如下:1.在生理酸度条件下（pH 7.4）,采用酶促动力学方法,研究了高良姜素、槲皮素和杨梅素对XOD的抑制作用。发现高良姜素、槲皮素和杨梅素均显示出良好的抑制XOD活性的能力,其半抑制浓度分别为（3.38±0.04）×10-6、（2.74±0.04）×10-6和（8.66±0.03）×10-6 mol L–1,进一步分析表明B环上羟基的数量对抑制尿酸的形成没有直接相关性。动力学研究表明,高良姜素对XOD的抑制类型为竞争型,它与黄嘌呤竞争性结合XOD的活性中心,从而影响XOD的催化活性。槲皮素和杨梅素则是一种可逆的混合型抑制剂。此外,XOD催化的反应是双底物反应,其催化过程符合乒乓机制。在此基础上,研究了高良姜素、槲皮素和杨梅素对XOD催化产生的O₂^-影响。实验结果表明,高良姜素等3种黄酮醇化合物均通过对XOD的抑制作用来降低O₂^-的生成量,它们的半抑制浓度分别为（6.31±0.02）×10-6、（2.90±0.03）×10-6和（4.55±0.02）×10-6 mol L–1。进一步分析发现,高良姜素通过竞争性抑制尿酸的形成,降低O₂^-生成量。杨梅素主要通过还原XOD,造成反应中间体EII只能催化O2生成H2O2,从而减少O₂^-的生成。而槲皮素对尿酸的抑制和对XOD的还原均起到降低O₂^-的作用。2.采用荧光光谱法联合分子模拟技术,深入探测了高良姜素、槲皮素和杨梅素与XOD的结合性质。高良姜素、槲皮素和杨梅素均通过与XOD形成基态复合物导致其内源荧光的猝灭,它们在298 K温度下的结合常数分别为（3.60±0.01）×104、（4.28±0.02）×104和（1.87±0.02）×104 L mol–1。获得的热力学参数表明,氢键和疏水作用力在高良姜素与XOD结合反应中起到主要驱动作用,氢键与范德华力是槲皮素和杨梅素与XOD发生结合的主要驱动力。分子模拟直观地展现了高良姜素、槲皮素和杨梅素在XOD中的结合姿态、结合区域与位点。高良姜素插入到了XOD的钼蝶呤（Molybdopterin,Mo-pt）中心,与氨基酸残基Asn768形成键长为2.049?的氢键,与其结合位点周围分布的Pro1076,Leu1014,Phe1009,Phe914,Phe883,Phe649,Leu648等疏水性氨基酸残基发生了疏水作用。槲皮素和杨梅素则结合到了黄素腺嘌呤二核苷酸（Flavin adenine dinucleotide,FAD）中心,槲皮素A环上5号和7号位羟基分别与氨基酸残基Glu263和Arg394间形成了键长为2.162和1.749?的两个氢键。杨梅素B环5′号位和C环3号位上的两个羟基分别与氨基酸残基Arg394和Ser1225上的氢形成两个氢键,它们的键长分别为2.107和2.208?,表明氢键在槲皮素和杨梅素与XOD相互作用中起着重要作用。3.在pH 7.4缓冲溶液中,利用同步荧光光谱和圆二色谱技术,研究了高良姜素、槲皮素和杨梅素对XOD构象的影响。槲皮素与XOD的结合反应会造成XOD中酪氨酸残基所处微环境疏水性增加,而色氨酸残基微环境疏水性降低。高良姜素和杨梅素对XOD中酪氨酸微环境疏水性影响却不大,但同样会造成色氨酸残基微环境疏水性降低。同步荧光猝灭比率（Ratios of Synchronous Fluorescence Quenching,RSFQ）分析表明,色氨酸残基对内源荧光猝灭的贡献较多,黄酮醇化合物在XOD中的结合位点更加靠近色氨酸。圆二色谱分析结果显示,高良姜素、槲皮素和杨梅素能够诱导XOD的二级结构发生变化,其中α-螺旋含量的增加可能会使XOD的结构更加致密,这不仅不利于酶活性中心的形成,还会阻碍底物黄嘌呤进入XOD的活性中心,从而影响XOD的催化活力。4.根据以上实验结果推断高良姜素等3种黄酮醇化合物对XOD的抑制机理如下:高良姜素通过竞争方式插入到XOD中的Mo-pt中心,从而占据了XOD的催化中心,这将妨碍黄嘌呤的进入,进而影响分子内电子转移,造成底物O2因无法获得足够电子而减少O₂^-的生成量。槲皮素和杨梅素则通过范德华力和氢键结合到了XOD中含FAD的活性中心（O2被还原生成O₂^-或H2O2的区域）,这将阻碍O₂^-的扩散,导致O₂^-进一步得到电子生成H2O2。槲皮素和杨梅素诱导XOD的二级结构发生改变,造成XOD的结构更加紧密（α-螺旋含量增加）,不利于Mo活性位点的暴露,阻碍黄嘌呤的进入,从而降低尿酸的生成量。5.Que-BSA NPs对槲皮素分子的包封率和载药量分别为（69.7±1.4）%和（8.96±1.2）%,平均粒径为（382.7±5.2）nm,粒径分布指数（PDI）为0.047,ζ-电位为（-46.0±1.2）mV。新鲜配制的纳米粒子大小较为均一,且分散体系在一周内较为稳定。扫描电镜图像显示,Que-BSA NPs近似球形。进一步研究发现,经BSA NPs包载的槲皮素在模拟胃肠道环境下仍然具有一定地抑制XOD的能力,表明BSA NPs在一定程度上保护了槲皮素的生物活性。