冠心病（coronary heart disease,CHD）作为进入二十世纪以来,威胁人类生命健康的主要疾病,其有效防治一直成为整个社会关注的重点和难点。但是CHD的发病机制至今仍不明了,成为阻滞其治疗进展的主要难题。动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是心脑血管疾病的发病的主要病理基础。以往关于AS形成的机制主要围绕三种学说,脂质沉淀学说、损伤修复学说和血栓形成学说。因而,高龄、血脂升高、吸烟、血压升高、血糖升高、高半胱氨酸血症以及高尿酸血症等导致血管内皮损伤和脂质沉积的内在因素,被界定为CHD发病的高危因素。远离这些危险因素,或者控制这些因素的恶化,在一定程度上取得了预防AS发生发展的成果。然而,随着CHD发病的逐渐年轻,进展逐渐加快,使得人们对危险因素的预防治疗提出了疑问。近年来,随着急性冠脉综合症（acutecoronary syndrome,ACS）这个CHD的急性进展阶段的界定,使得人们重新认识了CHD发展阶段的病理和病理生理特点。研究发现ACS的病理基础是易损斑块,并且发现易损斑块伴随着大量炎症细胞和免疫细胞的介入,是斑块不稳定和容易破裂的主要原因;ACS患者存在全身炎症因子和炎症反应活化的情况。进而,发现AS的所有阶段都有免疫细胞的介入,提出CHD是一种慢性炎症和自身免疫性疾病这一新观点,认为内在或外在危险因素导致的炎症和免疫反应是AS发病的基础。树突状细胞（Dendritic cells,DCs）是免疫过程中起负责抗原呈递的细胞,是机体内功能最强的专职抗原呈递细胞。极少量的DCs即可强烈激活T淋巴细胞启动特异性细胞免疫反应,其激活T淋巴细胞的能力是巨噬细胞或B细胞的100～1000倍,在免疫应答的诱导和调节中起重要作用。最近研究证实在动脉壁中有引起免疫反应发生的微环境,正常动脉内膜存在一种血管相关淋巴组织（Vascular-associated lymphoid tissue,VALT）,类似于呼吸道和胃肠道中的粘膜相关淋巴组织,散在分布着一些由免疫活性细胞和抗原呈递细胞组成的细胞群,对血管组织中可能有害的内源性或外源性抗原进行监视和筛查。VALT中发现有血管树突状细胞（Vascular dendritic cells,VDCs）的存在,正常的动脉壁中VDCs较少,属未成熟形式,主要分布在血管的内膜和外膜。VDCs在AS病变中聚集明显增加,在炎症浸润区域往往与T淋巴细胞和巨噬细胞聚集在一起。DCs与T淋巴细胞共同出现在AS的病变薄弱部位,使得人们推测DCs在AS的发生发展中可能同样起着启动炎症和免疫反应的作用。最近的研究显示氧化修饰的低密度脂蛋白和尼古丁可通过激活DCs介导的获得性免疫反应,促进AS病变的进展。说明DCs可能参与了AS的病理发生,在触发和放大AS炎症免疫反应中起重要的调节作用。然而,从DCs的发现和研究历史来看,DC仍是一种新型免疫细胞。不仅在不同的种群和不同个体DCs的成熟程度、功能状态和分型存在较大的差异,甚至同一个体的不同发育阶段,不同的组织环境下,其成熟、功能状态和亚组分型差别很大。目前公认,DC可以根据造血干细胞谱系划分为髓样DC和淋巴样DC,分别与DC1和DC2相对应。DC1亚群的表型为CD1a⁺、CD1b⁺、CD1c⁺、CD1d low、CD4 low、CD11b⁺、C D11c⁺、CD13⁺、CD 33⁺、CD 45RA^-、CD 45RO⁺、GM-CSFRa⁺、IL-3Ra low,表达高水平的MHC-1、Ⅱ分子、CD40,B7分子,能诱导Th0向Th1分化,诱导Th1样的免疫应答;而DC2亚群的表型为CD1a^-、CD1b^-、CD1c^-、CD1d^-、CD4^-、CD11b^-、C D11c low、CD13 low、CD 33 low、CD 45RA⁺、GM-CSFRa low、IL-3Ra⁺,相对低水平地表达MHCⅠ、Ⅱ分子、CD40、B7等分子,能诱导Th0细胞向Th2亚群分化,诱导Th2样的免疫应答,DC2主要分布于小肠粘膜下Peyer’s淋巴结、肺、胸腺和肝脏。不仅在不同的亚群,DCs的功能不同,在其不同成熟状态的DCs功能状态不同。未成熟的DCsⅠ、Ⅱ类MHC、共刺激因子及粘附分子表达量低,不能够激活T淋巴细胞,但有强大的捕获及加工处理抗原的能力,一旦捕获抗原后会转化为成熟形式,此时它的Ⅰ,Ⅱ类MHC、共刺激因子及粘附分子表达量增高,捕捉抗原的能力下降,而加工、递呈抗原、激活T淋巴细胞的能力则增强。DCs这种转化与免疫调节分子如CD40,CD80,CD83等表达的上调密切相关。如果AS的发病是以免疫系统的激活和炎症的介入为基础。那么这其中具有抗原呈递功能的DCs功能状态如何,正常人与CHD患者之间是否存在其功能蛋白和免疫调节分子的分泌不同,这些蛋白的基因表达是否发生变化。这些问题中,研究DCs的基因变化是问题关键。本课题分为三个部分,将分离的临床病例外周血单核细胞（peripheral bloodmononuclear cell,PBMC）和血清为研究对象,以研究外周血PBMC源性DCs基因表达和功能变化是否介入冠心病发生发展为切入点,通过免疫荧光、流式细胞术、基因芯片、RT-PCR和ELISA等方法,重点观察外周血PBMC源性DCs的成熟状态、免疫功能和其他基因表达的差异与AS发生发展的关系,深入探讨抗原呈递细胞功能变化在AS演变不同阶段的地位和作用。旨在为AS发生发展的免疫介导学说提供实验依据和免疫治疗途径,为心脑血管疾病的防治提供新的理论平台和技术手段,具有长远的经济价值和重要的社会意义。结果分述如下:1.ACS患者外周血来源的DCs处于成熟状态,并具有诱导T细胞增殖的能力1.1各组患者一般临床资料情况比较无显著性差异临床入选病例总共81例,其中AMI组20例、UAP组20例、SAP组20例、CPS组11例、对照组10例)一般临床资料的比较显示:各组的年龄、性别比例相比差异无显著性意义（P＞0.05）。各组中主要的心血管病危险因素,如:吸烟（Smoking）、高血压（Hypertension）、糖尿病（Diabetes mellitus）、总胆固醇（Totalcholesterol）、甘油三脂（Triglyceride）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL cholesterol）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL cholesterol）等,相互之间的比较差异无显著性意义（P＞0.05）;1.2体外诱导PBMC来源的DCs,流式细胞仪鉴定DCs细胞表型:倒置相差显微镜下的形态:培养第3天可见细胞贴壁生长,由圆形变为不规则形,并长出一些小刺状结构,细胞质变得丰富。培养第5天,树突样结构更加明显,胞质更加丰富,细胞逐渐悬浮或半贴壁。培养到7天后,细胞形态无明显改变,细胞开始聚集成细胞团,大部分悬浮或半贴壁,少数贴壁。台盼蓝染色细胞活力大于96%。流式细胞仪检测人外周血PBMC来源的DCs表型为CD1α⁺,CD80⁺,CD83^low,CD86⁺,HLA-DR⁺:1.3与自身血浆共同培养DCs上清液细胞因子IL-12检测结果:正常对照组、CPS组、SAP组、UAP组和AMI组上清液的IL-12表达量12小时样本测的分别为19.46±6.83,27.96±9.16,24.23±7.72,59.9±24.00和68.5±16.5pg/ml,24小时样本测的分别为45.84±17.64,49.04±16.62,52.1±16.55,129.41±46.60和130.86±30.68pg/ml和48小时测的分别为50.68±16.7,59.93±16.37,57.84±16.36,151.43±43.79和153.95±27pg/ml,IL-12在五组间差异有显著性意义（均P＜0.001）。LSD比较分析表明,UAP组和AMI组比正常对照组、CPS组和SAP组DCs上清培养液中IL-12浓度在12小时、24小时和48小时都升高;1.4各组DCs与自身血浆共孵育后FACS分析DCs表型变化情况:正常对照组、CPS组、SAP组、UAP组和AMI组PBMC来源的DCs细胞表面CD1α表达比例分别为11.08±3.82%,12.28±3.91%,13.71±5.53%,20.09±4.9%和20.57±4.75%。CD80比例分别46.78±16.86%,48.51±14.75%,46.81±15.92%,61.39±11.49%和60.91±17.77%。CD83比例分别为47.57±12.34%,46.59±10.22%,45.76±14.11%,54.17±16.41%和51.31±18.8%。CD86比例分别为46.83±7.45%,46.08±10.25%,45.76±17.75%,62.27±14.01%和67.98±17.03%。HLA-DR比例分别为79.01±11.05%,73.77±13.55%,72.16±17.11%,74.13±12.27%和79.23±9.79%。其中,CD1α、CD80和CD86等表型五组间比较差异有显著性意义(F_CD1α=13.4、F_CD80=4.138和F_CD86=8.672,均P＜0.05)。LSD比较分析表明,UAP组和AMI组比正常对照组、CPS组和SAP组CD1α、CD80和CD86表型表达细胞比例增加（均P＜0.05）;1.5各组患者DCs的同种混合淋巴细胞反应:正常对照组、CPS组、SAP组、UAP组和AMI组PBMC来源的DCs细胞与同种T淋巴细胞共孵育,在DCs细胞数与T细胞比例为1∶50时各组³H-TDR掺入率分别为1035.8±280.9,1054±247.39,1112.4±319.9、2633.6±426.1和2660.4±316.02cpm/2000cells;在DCs细胞数与T细胞比例为1∶20时各组³H-TDR掺入率分别为2043.8±303.5,2169.55±311.6,2139±295.1、5122.3±640.4和5069.1±748.9cpm/2000cells。³H-TDR掺入率在五组间存在显著性差异(F_1∶50=110.06和F_1∶20=155.2,P＜0.001)。LSD比较分析表明,UAP组和AMI组在³H-TDR掺入率较其他三组差异有显著性意义（P＜0.001）;而正常对照组、CPS组和SAP组之间³H-TDR掺入率差异无显著性意义（P＞0.05）;而且,DCs在与T淋巴细胞1∶50混合时UAP组和AMI组³H-TDR掺入率都明显增加;2.基因芯片检测外周血PBMC来源的DCs基因表达不同芯片检测的结果显示,ACS患者组功能蛋白表达基因中有5个基因呈明显上升,分别是G1P2、G1P3、IFIT4、IL-1β和MX1,这些都是高度相关的干扰素诱导蛋白基因。有17个基因呈明显下降表达,分别是ACPP、AIM2、ATM、CCR1、CCR5、CD1C、FCGR3A、IFI16、IL-16、IL-18、LY75、MAP4K3、TAP1、TAP2、TLR1、TNFRSF6和VCL等,分别属于抗原识别受体、细胞趋化因子受体、细胞因子和细胞内信号传导系统。如前所述,成熟的树突状细胞其抗原识别和摄取功能下降,而抗原提呈功能增强;最初为有关抗原加工的亚细胞结构蛋白的表达减少;而与抗原呈递相关的蛋白表达应该增多。我们的研究表明ACS患者外周血PBMC来源的DCs分别在抗原识别方面的受体如TLR1和FCGR3A等表达减低;而负责传输特异性抗原肽结合到MHC分子的TAP1和TAP2蛋白基因表达也同样下降;而CCR1和CCR5这两个趋化因子受体同样是具有趋化DCs迁徙到抗原所在区域的作用,在DCs成熟时则表达下降;而与细胞内信号传导系统高度相关的蛋白（如:MAP4K3）和某些细胞因子（如:IL-16和IL-18基因）表达下降则可能与DCs细胞信号自身传导和细胞间信号传导变化相关。而作为升高的表达基因,多为INF诱导蛋白,该组蛋白的结构和功能的研究尚处于起步阶段,仍未见报道IFIT等蛋白与DCs成熟型之间的关系报道;3.荧光定量PCR检测基因芯片结果,显示DCs基因芯片检测有较好的可信度应用荧光定量PCR检测芯片检测表达上调的基因MX1和IL-1β,以及表达下调的基因FIF16表达情况显示,ACS患者MX1和IL-1β基因表达较对照组增加幅度与基因芯片检测相似;而FIF16基因表达较对照组降低加幅度与基因芯片检测相似。通过上述三个部分的实验,我们能够得出以下结论:①ACS患者外周血PBMC源的DCs细胞表型表达处于成熟状态,ACS患者体DCs处于成熟活化状态:②ACS患者外周PBMC来源的DCs,分泌IL-12水平较对照组明显升高,且具有诱导同种T淋巴细胞增殖的能力;③ACS患者组功能蛋白表达基因中有5个基因呈明显上升,分别是G1P2、G1P3、IFIT4、IL-1β和MX1,这些都是高度相关的干扰素诱导蛋白基因。有17个基因呈明显下降表达,分别是ACPP、AIM2、ATM、CCR1、CCR5、CD1C、FCGR3A、IFI16、IL-16、IL-18、LY75、MAP4K3、TAP1、TAP2、TLR1、TNFRSF6和VCL等,分别属于抗原识别受体、细胞趋化因子受体、细胞因子和细胞内信号传导系统:④荧光定量PCR检测芯片检测表达上调的基因MX1和IL-1β,以及表达下调的基因FIF16表达情况,验证了芯片检测的结果。