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近年来,人们越来越多的关注于中草药对机体免疫功能的调节作用,通过对这些中草药免疫调节功能的研究,有助于开发出具有临床应用价值的免疫调节剂。
地黄为玄参科(Scrophulariaceae)植物地黄 (Rehmannia glutinosa L.)的新鲜或干燥块根,是常用的一种传统补益类中药。生地黄为地黄的干燥块根,具有清热凉血,养阴生津之功效[1]。熟地黄为生地黄的加工炮制品,具有滋阴补血、益精填髓之功效。
国内外对地黄的化学成分、提取工艺、药理作用等进行了大量研究,研究发现地黄可以增强机体免疫功能。本实验室前期侯委位师姐采用 95%乙醇回流药渣水提法,分别得到生地黄的 95%乙醇提取物、药渣水提物、粗多糖和药渣水提物去多糖部位。通过体外淋巴细胞增殖实验研究发现生地黄发挥免疫低下作用的有效部位为 95%乙醇提取物和药渣水提物去多糖部位；发挥免疫增强作用的有效成分为粗多糖成分。提示生地黄粗多糖具有免疫增强作用。
前期研究主要作了体外免疫筛选实验,接下来我们拟对生地黄多糖成分的免疫增强作用作进一步的体外和体内验证实验。包括生地黄多糖对淋巴细胞增殖实验和免疫低下小鼠模型实验,为进一步探讨生地黄的免疫调节作用机制提供理论依据。
目的：考察生地黄多糖体外免疫调节作用,以及生地黄多糖对免疫低下模型的体内免疫调节作用。
方法：生地黄95%乙醇部位多糖提取物(下文简称RPE)：将生地黄切厚片,称取9.8 kg,加入10倍量 (w/v=1：10) 95%乙醇回流提取2次,每次2 h,合并滤液减压浓缩干燥后用水溶,水溶液上Diaion HP-20柱,用水洗脱后合并滤液减压浓缩干燥得到生地黄95%部位多糖1.4582 kg,得率14.88%。
生地黄水部位多糖提取物(下文简称RPW)：剩余药渣加入10倍量 (w/v=1：10) 蒸馏水在水浴中提取2次 ,每次2 h,合并滤液减压浓缩干燥,得药渣水提物。药渣水提物加入适量蒸馏水超声溶解后,再加入95%乙醇至醇含量在80%以上,不断搅拌,有大量沉淀产生,4℃过夜,6000 r·min-1,离心15min,分别收集沉淀和上清液,上清液减压浓缩后,重复上述操作,收集后的沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚相继洗涤,减压浓缩干燥,即得生地黄水部位多糖提取物1.6836 kg,得率17.18%。
体外实验中,常规分离Balb/c小鼠胸腺及脾的淋巴细胞,通过MTT法检测RPE、RPW对小鼠胸腺、脾淋巴细胞增殖水平。
体内实验采用环磷酰胺诱导免疫低下小鼠模型,通过小鼠单核吞噬细胞碳粒廓清率实验检测生地多糖对免疫低下小鼠固有免疫的影响；通过血常规、脏器指数、ELISA法、流式细胞术检测生地多糖对免疫低下小鼠适应性免疫的影响。
结果：体外实验结果显示,与Con A刺激前对照组相比,RPW 1 mg·mL-1、RPE 1 mg·mL-1剂量组均可显著性促进胸腺淋巴细胞增殖 (P<0.05)；RPW 10 mg·mL-1、RPE10 mg·mL-1剂量组均可极显著性促进胸腺淋巴细胞增殖 (P<0.01)。Con A刺激后,与Con A刺激前对照组相比,Con A可极显著性促进其细胞增殖(P<0.01)；RPW、RPE各剂量组均可进一步显著性促进其细胞增殖 (P<0.01,P<0.05)。
与Con A刺激前对照组相比,RPW 1 mg·mL-1剂量组可显著性促进脾淋巴细胞增殖 (P<0.05)；RPW 0.1 mg·mL-1、10 mg·mL-1、RPE 0.1 mg·mL-1、1 mg·mL-1、10 mg·mL-1剂量组均可极显性著促进脾淋巴细胞增殖 (P<0.01)。Con A刺激后,与Con A刺激前对照组相比,Con A可极显著性促进脾细胞增殖(P<0.01),RPW、RPE各剂量组均可进一步极显著性促进脾细胞增殖 (P<0.01)。
免疫低下小鼠模型实验结果显示生地多糖对免疫低下模型小鼠体重影响无统计学差异；能够显著提高免疫低下小鼠体内吞噬系数 K(P<0.05)并有提高吞噬指数 α 的趋势；显著提高血液白细胞数(P<0.01)、血小板数(P<0.01)、淋巴细胞数(P<0.01)及中性粒细胞数(P<0.05),对红细胞数的影响和模型组相比无差异；RPW可以显著提高免疫低下小鼠脾脏指数(P<0.01),对胸腺指数的影响和模型组相比无差异,RPE可以显著提高免疫低下小鼠胸腺指数(P<0.05)及脾脏指数(P<0.01)；显著提高 IFN-γ(P<0.01)、IL-4(P<0.01)、IL-10(P<0.01)的表达水平,显著降低TNF-α(P<0.01)、IL-17(P<0.01)的表达水平；显著提高脾淋巴细胞CD3+CD4+的表达水平(P<0.01),降低 CD3+CD8+的表达水平( P<0.01 ),提高脾淋巴细胞 CD3+CD4+/CD3+CD8+比值(P<0.01)。
结论：生地黄多糖提取物具有显著的体外免疫增强作用,RPW、RPE均可显著性促进Con A刺激前后小鼠胸腺淋巴细胞和脾淋巴细胞增殖。
实验结果显示生地黄多糖能够提高免疫低下小鼠体内吞噬指数；显著提高血液白细胞、血小板、淋巴细胞、中性粒细胞数；显著提高免疫低下小鼠的胸腺指数和脾脏指数；调节血清中 TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17 的表达水平；提高脾淋巴细胞CD3+CD4+/CD3+CD8+比值。提示生地黄多糖能够调节免疫低下小鼠的固有免疫和适应性免疫,具有免疫增强作用。