论文部分内容阅读
目的：TGF-β1诱导食管鳞状细胞癌细胞发生上皮-间质转化（EMT）后，通过DAPT下调Notch-1信号通路，探讨Notch-1在食管鳞状细胞癌EMT中的作用。方法：1.利用TGF-β1诱导食管鳞状细胞癌细胞（Eca-109）发生EMT，筛选TGF-β1最佳诱导浓度。分别加入0ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/mlTGF-β1，48h后CCK-8检测细胞活力，Western-blotting检测E-cadherin、Vimentin的表达变化。2.探索Notch-1信号通路在食管鳞状细胞癌EMT中的效应，筛选DAPT最佳抑制浓度，分别加入0μM、5μM、10μM、15μM、20μM DAPT，48h后CCK-8检测细胞活力，Western-blotting检测E-cadherin、Vimentin的表达变化。3.探寻DAPT下调Notch-1信号通路后对食管鳞状细胞癌EMT的作用。实验分为Control、DMSO、DMSO+TGF-β1、TGF-β1、TGF-β1+DAPT、DAPT组，48h后IF检测E-cadherin、Vimentin的表达，Western-blotting检测Notch-1ICD、Hes-1表达改变；4W后结晶紫染色，细胞克隆计数；观察Eca-109细胞0h、6h、12h、24h迁移能力变化。结果：1.蛋白质免疫印迹检测E-cadherin与Vimentin的表达情况，在TGF-β1-5ng/ml组中，E-Cadherin表达量显著减少，与Control组、0.5、1、2ng/ml组比较有显著性差异（P<0.05），与10ng/ml组比较无显著性差异（P>0.05）；Vimentin表达量显著增多，与Control组、0.5、1、2ng/ml组比较有显著性差异（P<0.05），与10ng/ml组比较无显著性差异（P>0.05），筛选出TGF-β1诱导Eca-109发生EMT最佳浓度为5ng/ml。2.在DAPT(15μmol/ml)+TGF-β1(5ng/ml)组中，E-Cadherin蛋白表达量显著增多，与Control组、DAPT(5/10μmol/ml)+TGF-β1(5ng/ml)组比较有显著性差异(P<0.05)，与DAPT(20μmol/ml)+TGF-β1(5ng/ml)组比较无显著性差异(P>0.05)；Vimentin蛋白表达量显著减少，与Control组、DAPT(5/10μmol/ml)+TGF-β1(5ng/ml)组比较有显著性差异（P<0.05），与DAPT (20μmol/ml)+TGF-β1(5ng/ml)组比较无显著性差异（P>0.05），筛选DAPT最佳抑制浓度为15μmol/ml。3. Notch-1ICD与Hes-1的表达情况，在TGF-β1(5ng/ml)组，蛋白表达量显著增多，与DMSO(5μl)+TGF-β1(5ng/ml)组比较，无显著性差异(P>0.05)，与Control(0μmol/ml)组、 DMSO(5μl)组、 DAPT(15μmol/ml)+TGF-β1(5ng/ml)组、 DAPT(15μmol/ml)组比较有显著性差异(P<0.05)；在DAPT(15μmol/ml)+TGF-β1(5ng/ml)组蛋白显著减少，与Control (0μmol/ml)组、DMSO(5μl)组、DMSO(5μl)+TGF-β1(5ng/ml)、TGF-β1(5ng/ml)组、DAPT (15μmol/ml)组比较有显著性差异(P<0.05)。4. E-cadherin与Vimentin的在细胞内的表达定位，E-cadherin表达于细胞膜、Vimentin表达于细胞浆，细胞核也有少量表达。5.下调Notch-1信号通路后，Eca-109克隆结果提示在TGF-β1(5ng/ml)组的克隆个数最多，与DMSO(5μl)+TGF-β1(5ng/ml)组比较，无显著性差异（P>0.05），与Control (0μmol/ml)组、DMSO(5μl)组、DAPT (15μmol/ml)+TGF-β1(5ng/ml)组、 DAPT (15μmol/ml)组比较有显著性差异。在DAPT (15μmol/ml)+TGF-β1(5ng/ml)组中，Eca-109克隆形成率及个数明显减少，与Control (0μmol/ml)组、DMSO(5μl)组、DMSO (5μl)+TGF-β1(5ng/ml)、TGF-β1(5ng/ml)组、DAPT(15μmol/ml)组比较有显著性差异(P<0.05)。6.下调Notch-1信号通路后，划痕实验显示Eca-109在TGF-β1(5ng/ml)组的迁移距离最远，与DMSO (5μl)+TGF-β1(5ng/ml)组比较，无显著性差异（P>0.05），与Control (0μmol/ml)组、DMSO(5μl)组、DAPT(15μmol/ml)+TGF-β1(5ng/ml)组、DAPT (15μmol/ml)组比较有显著性差异。在DAPT(15μmol/ml)+TGF-β1(5ng/ml)组中，Eca-109迁移距离明显下降，与Control (0μmol/ml)组、DMSO(5μl)组、DMSO(5μl)+TGF-β1(5ng/ml)、TGF-β1(5ng/ml)组、DAPT (15μmol/ml)组比较有显著性差异(P<0.05)。结论：下调Notch-1信号通路可抑制TGF-β1诱导的食管鳞状癌细胞EMT，降低食管鳞状癌细胞的增殖及侵袭能力。