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研究背景甲状腺癌是最常见的内分泌系统恶性肿瘤,在中青年女性中高发,其中甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma,PTC）是最常见的类型,约占80-90%。临床上采用根治性手术辅以促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone,TSH）抑制治疗以及适当的I131同位素治疗,PTC患者的十年生存率达90%以上。但少数PTC患者出现肿瘤复发或对同位素治疗抵抗,甚至远处转移至肺、骨、脑等,是影响甲状腺癌患者总体预后的重要因素。BRAF突变（全文代指BRAF基因的V600E点突变）是PTC中最常见的分子事件,文献报道它与PTC较大的肿瘤直径、腺外浸润、淋巴结转移等侵袭性临床病理特征以及不良预后相关。近年来还有研究发现在BRAF突变的PTC中双侧性和多灶性发生率高,并且双侧性和多灶性可促进肿瘤恶性生物学行为的发展,显著增加患者的复发风险。此外,最新研究结果提示PTC患者的BRAF突变状态影响男性、高龄这两个临床病理特征在预测肿瘤相关死亡风险中的价值:在BRAF突变型患者中男性、高龄提示更高的肿瘤相关死亡风险,但在BRAF野生型患者中两者不相关。除了BRAF基因,端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase,TERT）启动子突变也与PTC的高侵袭性临床病理特征相关并对于预测复发死亡风险具有重要意义。文献报道联合TERT启动子突变和BRAF突变有助于预测恶性程度更高的肿瘤生物学特征。靶向BRAF的特异性抑制剂Vemurafenib对BRAF突变的晚期恶性黑色素瘤疗效显著,已用于临床。II期临床试验结果提示Vemurafenib对于复发转移性、不可切除、且I131治疗不敏感的BRAF突变型甲状腺癌患者具有一定疗效,但相较于其他BRAF突变的肿瘤,总体反应率较低且易发生耐药。与临床疗效结果相类似,大多数携带BRAFV600E突变的甲状腺癌细胞株对Vemurafenib的敏感性也不高。目前靶向BRAF治疗耐药的原因尚未完全阐明:研究报道丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路的重新活化、Erb B家族蛋白的高表达、PI3K/Akt/m TOR等旁路的诱导激活等多种机制可能参与了甲状腺癌靶向BRAF治疗的耐药过程。目前尚缺乏包含长期随访信息的大样本中国人群甲状腺乳头状癌BRAF突变的临床研究。本研究基于千余例的甲状腺癌临床及随访数据,并结合BRAF基因、TERT启动子的突变情况,拟系统性多角度探索BRAF突变在预测甲状腺乳头状癌侵袭性生物学行为和复发风险中的价值,旨在优化BRAF突变型PTC患者的治疗方案和随访策略。同时,针对目前靶向BRAF治疗耐药的困境,探索其潜在的发生机制,将有助于为克服甲状腺癌靶向治疗耐药提供科学的依据和指导,以其提高甲状腺癌患者的整体预后水平。第一部分:BRAF突变在预测甲状腺乳头状癌高危临床病理特征和复发风险中的价值研究目的:基于1002例甲状腺乳头状癌临床病理及随访数据,系统研究BRAFV600E突变在预测甲状腺乳头状癌高危临床病理特征和复发风险中的价值。方法:回顾性分析2008年1月至2015年6月期间在浙江大学附属第一医院肿瘤外科经手术切除病理确诊为甲状腺乳头状癌的病例,按照纳入及排除标准筛选病例,完善临床病理特征和随访信息。提取甲状腺乳头状癌患者新鲜冰冻组织标本的全基因组DNA共1002例,通过直接测序法检测BRAFV600E突变率和TERT启动子突变率。统计学方法分析突变与临床病理特征以及复发风险的相关性。结果:在1002例甲状腺乳头状癌中BRAFV600E突变率为72.7%,TERT启动子突变率为1.7%。BRAF突变的甲状腺乳头状癌中双侧性（P=0.01）和多灶性（P=0.017）发生率显著增高,合并桥本氏甲状腺炎的几率显著降低（P<0.0001）。双侧性和多灶性提示甲状腺乳头状癌的腺外浸润、淋巴结转移、更大的肿瘤直径等侵袭性生物学行为以及不良预后（更高的MACIS评分）,而合并桥本氏甲状腺炎无明显提示价值。TERT启动子突变与高龄、男性倾向、大肿瘤直径、腺外浸润、疾病分期晚等高危临床病理特征相关,两者共同突变的肿瘤具有更高的恶性程度和更高的复发风险。肿瘤双侧性（P=0.04）、肿瘤最大直径超过10 mm（P=0.004）、TERT启动子突变（P=0.049）是影响甲状腺乳头状癌患者复发的独立危险因素。双侧性、腺外浸润在BRAF突变型患者中提示更高的复发风险,而在BRAF野生型患者中价值有限;较大的肿瘤直径在BRAF野生型患者中提示更高的复发风险,而在BRAF突变型患者中价值有限。淋巴结转移在BRAF突变型和BRAF野生型患者中均为复发的高危因素。结论:在甲状腺乳头状癌中,BRAF基因突变与肿瘤的双侧性和多灶性等侵袭性临床病理特征密切相关;BRAF突变的患者若同时存在TERT启动子突变,则具有更高的复发风险;BRAF突变的患者其肿瘤双侧性及腺外浸润是预测复发的独立危险因素。第二部分:VCAM-1与靶向BRAF治疗耐药相关机制研究目的:为了探索与靶向BRAF治疗耐药相关的分子生物学事件,本研究对比了BRAFV600E突变的甲状腺癌BCPAP细胞在Vemurafenib作用前后的转录组表达改变,发现药物作用后血管细胞粘附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1）表达显著上调。本部分研究旨在明确VCAM-1在靶向BRAF治疗耐药中的作用并初步探索其在甲状腺癌中的生物学功能。方法:运用Illumina Hi Seq 4000表达谱测序并进行生物信息学分析;si RNA敲低药物诱导上调的VCAM-1以及慢病毒载体转染过表达VCAM-1后,运用CCK-8药物毒性试验和细胞周期、凋亡实验评价VCAM-1在甲状腺癌细胞靶向治疗中的作用;运用通路抑制剂研究VCAM-1上调的潜在分子机制;通过稳定过表达VCAM-1的细胞株于体外研究该基因在甲状腺癌细胞中的生物学功能;检测50对甲状腺乳头状癌组织样本中的VCAM-1表达水平并进行临床病理特征相关性分析,进一步评估VCAM-1在甲状腺癌中的作用。结果:高通量测序检测甲状腺癌细胞BCPAP在靶向治疗前后RNA水平的变化,发现VCAM-1的表达被显著上调并呈时间依赖性和剂量依赖性。敲低诱导上调的VCAM-1表达增强了Vemurafenib的抗肿瘤效应,而过表达VCAM-1降低了肿瘤细胞对Vemurafenib的药物敏感性。进一步研究表明,PI3K-Akt-m TOR通路在BRAF抑制过程中被磷酸化激活,联合Akt抑制剂MK2206可显著降低BRAF抑制过程中被诱导上调的VCAM-1并协同抑制甲状腺癌细胞的生长。此外,在体外试验中发现VCAM-1促进甲状腺癌细胞的迁移和侵袭,不影响甲状腺癌细胞的生长、增殖、凋亡、克隆形成能力;在甲状腺乳头状癌临床组织样本中发现VCAM-1表达与淋巴结转移呈正相关。结论:甲状腺癌靶向BRAF抑制剂Vemurafenib诱导VCAM-1的高表达,表达上调的VCAM-1降低了靶向治疗敏感性,并且与甲状腺癌侵袭、迁移的恶性表型有关。Akt的磷酸化激活可能是其上调的原因,联合Akt抑制剂可以增敏Vemurafenib对BRAF突变型甲状腺癌的疗效。