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单硝基酚包括2-硝基酚,3-硝基酚和4-4肖基酚,被广泛应用于医药、农药、染料及化工产业中。这些化合物及其转化产物具有毒性及致畸性。研究人员从自然界中分离到了能够利用单硝基酚作为唯一碳源、氮源、能源生长的菌株,并用于硝基酚污染环境的生物修复中。2-硝基酚[1,2]和4-硝基酚[3,4]的单加氧起始代谢途径在分子水平和生化水平均已得到了阐述。相对而言,3-硝基酚的的部分还原代谢途径是由依赖于NADPH的硝基还原酶催化生成间羟氨酚,接着在PseudomonasputidaB2中由间羟氨酚裂解酶催化生成1,2,4-偏苯三酚[5],或在CupriavidusnecatorJMP134中由间羟氨酚变位酶催化生成氨基对苯二酚[6]。目前为止,还没有对于3-硝基酚降解基因的分子生物学的报道,也没有参与代谢起始的硝基还原酶的纯化及酶学性质研究。由于菌株B2中的硝基还原酶活性非常不稳定,因此从菌株B2中纯化硝基还原酶并不成功[5]。另外,在菌株JMP134中部分纯化的组分经鉴定可以还原3-硝基酚生成3-羟氨酚,并经纯化的3-羟氨酚变位酶催化通过Bamberger重排生成氨基对苯二酚[7]。根据已公布的JMP134的全基因组序列的生物信息学分析推测基因簇mnp及glnA(编码3-羟氨酚变位酶)可能编码间硝基酚代谢相关酶。
为了通过实验数据证实以上推测,本文研究了菌株JMP134中3-硝基酚代谢起始相关基因和酶。Real-timePCR结果显示相对于未经3-硝基酚诱导的JMP134,基因mnpA和mnpC在3-硝基酚诱导的菌株中高水平转录,这表明mnpA和mnpC在JMP134降解3-硝基酚的过程中起到重要作用。MnpA和MnpC经His标签被纯化成单一条带后经分子筛鉴定是同源二聚体。MnpA是FMN紧密结合的黄素蛋白,在NADPH和O2的作用下还原3-硝基酚经3-亚硝基酚生成3-羟氨酚。LC-DAD-TOF/MS鉴定了间羟氨酚及中间产物3-亚硝基酚的存在。Km,Kcat值,及该基因可诱导性转录表明3-硝基酚很可能是MnpA的天然底物。进化分析揭示包括MnpA在内的具有明确异源物质降解功能的硝基还原酶在nitro-FMN-reductase超家族中组成一个新的分支。此外,MnpC是该亚家族中第一个被纯化至单一条带的的间位开环酶。该酶依赖Fe2+和Mn2+,催化对苯二酚生成4-羟基粘康酸半醛的间位开环酶,并且很可能在催化3-硝基酚降解的过程中将氨基对苯二酚间位开环。