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[目的]研究推拿在轴突生长导向机制以及其信号转导中的作用,以进一步揭示推拿促进周围神经损伤恢复的机理,完善推拿治疗周围神经损伤的理论基础,为临床应用推拿治疗周围神经损伤疾病,改善患者的症状及预后提供有力科学证据。[方法]采用按摩推拿手法模拟仪模拟推拿手法,对坐骨神经损伤(Sciatic Nerve Injury, SNI)模型大鼠进行定性、定量干预,再通过以下三方面研究推拿对轴突生长导向机制的影响：1通过斜板试验和光热耐痛阈观察大鼠行为学情况,采用透射电镜观察并分析坐骨神经损伤点轴突、髓鞘、雪旺细胞等超微结构的改变,从而进一步探寻推拿促进周围神经损伤恢复的形态学证据。2在得出推拿治疗周围神经损伤的超微形态学证据基础上,通过免疫组织化学、分子生物学方法,检测L3-L5节段脊髓腹角、坐骨神经损伤点中轴突生长导向因子及其受体等相关指标的变化,阐释推拿对轴突生长导向机制的影响。3为进一步验证推拿是否能够调控轴突生长的导向,采用Rho GTPase抑制剂NSC23766阻断轴突生长导向机制中Rho GTPase信号的转导,观察大鼠坐骨神经功能的改变情况,检测坐骨神经损伤点处神经元骨架蛋白F-actin和Tublin的表达变化,分析推拿是否通过调控轴突生长导向机制的信号转导来调节生长锥的细胞骨架,进而使再生神经的生长得到精确导向,从而恢复靶器官的功能。[结果]1推拿可以促进SNI模型大鼠神经超微结构的恢复1.1行为学结果：推拿组造模后7d的行为学表现与模型组相同(P>0.05),经推拿治疗20次后,大鼠的斜板试验与光热耐痛阈结果与模型组相比均有显著差异(P<0.05),且接近假手术组水平(P<0,05),说明经过推拿治疗,大鼠的运动和感觉功能均得到了一定程度的恢复。1.2电镜观察结果：电镜下模型组造模后28d的髓鞘严重损伤,髓鞘结构模糊、松散,出现空泡状变性,轴索萎缩或消失,雪旺细胞线粒体空泡化,细胞趋于坏死,表明神经受损严重,且与所观察到的大鼠行为学表现相一致。与模型组比较,经过推拿治疗20次后治疗组大鼠坐骨神经电镜下仅见部分髓鞘分层、空泡化,轴索无明显肿胀,部分线粒体发生肿胀、嵴断裂或空泡化,雪旺细胞部分空泡化或线粒体水肿,损伤程度较模型组轻。推拿组有髓神经的髓鞘厚度和轴突直径与模型组比较,均有显著性升高(P<0.05),且逐渐接近假手术组水平(P<0.05)。以上结果提示：推拿对周围神经损伤后超微结构的修复和再生有明显的促进作用,为推拿对SNI大鼠神经损伤恢复提供了超微形态学证据。2推拿可以促进SNI模型大鼠轴突生长导向因子及其受体的表达2.1轴突生长导向因子Netrin1及其mRNA的表达变化干预0次,在L3-L5节段脊髓腹角和坐骨神经损伤点中Netrinl平均积分光密度、相对蛋白含量以及mRNA表达量,模型组、模型对照组和推拿组与正常组相比均有显著性增高(P<0.05),假手术组与正常组相比无差异(P>0.05)。干预20次后,模型组、模型对照组和推拿组仍显著高于正常组(P<0.05),模型组和模型对照组之间无显著性差异(P>0.05),推拿组与模型组、模型对照组相比有显著性增高(P<0.05)。2.2轴突生长导向因子Netrin1的受体DCC的表达变化干预0次,模型组、模型对照组和推拿组的脊髓和神经中DCC平均积分光密度与正常组相比均有显著性增高(P<0.05),假手术组与正常组相比无差异(P>0.05)。干预20次后,脊髓中模型组、模型对照组和推拿组仍显著高于正常组(P<0.05),模型组和模型对照组之间无显著性差异(P>0.05),推拿组与模型组和模型对照组相比有显著性增高(P<0.05)；而在神经中模型组、模型对照组与正常组相比已无差异(P>0.05),但推拿组仍显著高于正常组(P<0.05),与模型组和模型对照组相比也有显著性差异(P<0.05)。2.3轴突生长导向因子Netrinl的受体UNC5A的表达变化干预0次,模型组、模型对照组和推拿组的脊髓和神经中UNC5A平均积分光密度与正常组相比均有显著性增高(P<0.01),假手术组与正常组相比无差异(P>0.05)。干预20次后,脊髓中模型组、模型对照组和推拿组仍显著高于正常组(P<0.05),模型组和模型对照组之间无显著性差异(P>0.05),推拿组与模型组和模型对照组相比有显著性增高(P<0.05)；而神经中模型组、模型对照组和推拿组仍显著高于正常组(P<0.01),模型组和模型对照组之间无显著性差异(P>0.05),推拿组与模型组和模型对照组相比有显著性增高(P<0.01)。2.4轴突生长导向因子Slit2及其mRNA的表达变化干预0次,在L3-L5节段脊髓腹角和坐骨神经损伤点中Slit2平均积分光密度、相对蛋白含量以及mRNA表达量,模型组、模型对照组和推拿组与正常组相比均有显著性增高(P<0.05),假手术组与正常组相比无差异(P>0.05)。干预20次后,模型组、模型对照组和推拿组仍显著高于正常组(P<0.05),模型组和模型对照组之间无显著性差异(P>0.05),推拿组与模型组和模型对照组相比有显著性增高(P<0.05)。2.5轴突生长导向因子Slit2的受体Robo1的表达变化干预0次,模型组、模型对照组和推拿组的脊髓和神经中Robo1平均积分光密度与正常组相比均有显著性增高(P<0.05),假手术组与正常组相比无差异(P>0.05)。干预20次后,脊髓中模型组、模型对照组和推拿组仍显著高于正常组(P<0.01),但三组之间无显著性差异(P>0.05)；而神经中模型组和模型对照组仍显著高于正常组(P<0.05),且两组之间无显著性差异(P>0.05),推拿组与正常组相比差异极其显著(P<0.01),与模型组和模型对照组相比也有明显增高(P<0.05)。以上结果提示：推拿能够同时促进SNI大鼠神经损伤点和L3-L5节段脊髓中轴突导向因子Netrin1及其受体DCC/UNC5A的合成和分泌；推拿可以促进SNI大鼠神经损伤点和相应脊髓节段中轴突导向因子Slit2的表达,但只能促进神经中Slit2受体Robo1的表达；推拿能维持SNI大鼠神经损伤点Netrin1受体DCC/UNC5A之间,Netrin1和Slit2之间在时间表达变化上的均衡。3推拿可以通过Rho GTPase信号转导影响轴突导向3.1坐骨神经功能指数(SFI)结果：在造模后1d、造模后7d(干预0次),模型组、推拿组、推拿+抑制剂组和推拿+盐水组的SFI结果与假手术组相比均有显著性降低(P<0.01)。造模后14d,四组仍显著低于假手术组(P<0.01),但推拿组和推拿+盐水组与造模后7d相比有一定升高。造模后21d,模型组和推拿+抑制剂组仍显著低于假手术组(P<0.01)；推拿组和推拿+盐水组与模型组相比有显著性升高(P<0.05),且已与正常组无显著性差异(P>0.05)；推拿+抑制剂组要高于模型组(P<0.05),但显著低于推拿组和推拿+盐水组(P<0.05)。造模后28d,四组与造模后21d相比,均有一定程度恢复；模型组和推拿+抑制剂组虽有一定升高,但仍低于假手术组(P<0.05)；推拿组和推拿+盐水组与模型组相比有显著性升高(P<0.05),且已基本达到正常组水平(P>0.05)；推拿+抑制剂组要高于模型组(P<0.05),但仍低于推拿组和推拿+盐水组(P<0.05)。3.2细胞骨架蛋白表达结果：干预0次,模型组、推拿组、推拿+抑制剂组和推拿+盐水组的F-actin和Tublin的平均积分光密度与假手术组相比均有显著性降低(P<0.05)。干预20次后,四组仍显著低于假手术组(P<0.05),但推拿组和推拿+盐水组与模型组相比有明显升高(P<0.05),推拿+抑制剂组与模型组相比没有差异(P>0.05),且明显低于推拿组和推拿+盐水组(P<0.05)。免疫荧光结果与免疫组化基本一致：假手术组的F-actin和Tublin在干预0次和干预20次时均可见大量绿色荧光着色的免疫阳性颗粒,亮度高,着色深,荧光强度明显高于其他各组；模型组的F-actin和Tublin在干预0次和干预20次时均只见少量绿色荧光阳性颗粒,干预20次时荧光强度明显弱于其他各组；推拿组和推拿+盐水组荧光强度和着色分布肉眼难以区分差别,但干预20次后,二者的着色深度与模型组比较,荧光强度明显增强；干预20次后,推拿+抑制剂组着色颗粒少于推拿组和推拿+盐水组,但荧光强度仍高于模型组。以上结果提示：轴突导向信号转导的关键分子Rho GTPase被抑制后,推拿对细胞骨架蛋白中肌动蛋白F-actin和微管蛋白Tublin的表达促进作用以及坐骨神经功能都受到了抑制。[结论]1推拿可以促进SNI大鼠坐骨神经纤维髓鞘的再生,轴索的恢复,减轻雪旺细胞胞质和线粒体的水肿,对周围神经损伤后超微结构的修复和再生有明显的促进作用,为推拿治疗周围神经损伤类疾病提供了超微形态学证据。2推拿能够促进轴突导向因子Netrin1及其受体DCC/UNC5A,Slit2及其受体Robol的表达,并能维持它们所介导的吸引和排斥信号的相互制约平衡,这可能是推拿能够促进轴突精确导向,重新成功支配靶器官的机制之一。3推拿可以通过轴突导向信号的转导促进细胞骨架蛋白F-actin和Tublin的表达,调控再生轴突细胞骨架结构的重建和运动,从而影响轴突的定向生长,完成神经的再生修复。以上结论相互印证,说明了推拿可以通过轴突导向机制调控再生轴突的生长和导向,表现为神经形态和功能上的恢复,最终使靶器官得到正确的再支配,从而促进了周围神经损伤引起的神经、肌肉,感觉、运动等各症状的恢复。