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草鱼(Ctenopharyngodon idellus)作为我国最大的淡水鱼类养殖品种,在湖北省以至全国都有很大的养殖规模,随着养殖密度和养殖规模的增加,疾病暴发在所难免。其中由柱状黄杆菌(Flavobacterium cloumnare)引起的草鱼烂鳃病是危害草鱼养殖产业的重要疾病,每年都会给草鱼的养殖业造成很大的经济损失。过去几年,使用抗菌药物防治柱形病已经导致多重耐药菌株的出现。免疫增强剂具有副作用小、可引起特定的细胞反应和预防某些特定的病原体等优点,在水产养殖中已有部分应用。相关研究表明,细菌胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)可以增强鱼类抵抗病原感染的能力,提高其免疫应答水平,是亟待开发的新型多糖类免疫增强剂。目前开发较多的是海洋和极地微生物的胞外多糖,水产动物致病菌的胞外多糖因其特殊的免疫原性,有望成为新型的免疫增强剂。因此,本研究以草鱼为研究对象,探究柱状黄杆菌的EPS作为免疫增强剂对草鱼免疫功能的影响。主要的研究结果如下:1.柱状黄杆菌EPS的制备。用本实验室前期从黄颡鱼病鱼上分离的一株柱状黄杆菌Pf1,发酵培养得到含大量胞外多糖的上清液,经三氯乙酸除蛋白、乙醇反复沉淀、蒸馏水透析、PEG20000浓缩后得到纯度较高的EPS。用苯酚硫酸法测得EPS的浓度为1.2 mg/m L。2.EPS对草鱼血清酶及免疫保护率的影响研究。采用酶标仪检测草鱼血清中酶的活力,注射EPS的草鱼与对照组相比,用柱状黄杆菌浸泡感染前,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)活性显著降低,细菌感染后,AKP酶活性显著升高,并在第4天时,酶活性最大;实验组在感染的第2 d,超氧化物歧化酶(Super oxide Dismutase,SOD)活性显著高于对照组,达到最大;草鱼注射0.2 mg EPS一周后,与对照组相比,在浸泡感染柱状黄杆菌的第14 d,注射EPS的草鱼存活率为85%,远高于对照组的55%,草鱼的免疫保护率为67%。该结果表明,柱状黄杆菌产生的EPS可作为免疫增强剂使用。3.EPS对草鱼免疫相关基因影响的研究。实时荧光定量PCR检测结果表明,草鱼注射0.2 mg EPS一周后,与对照组相比,在浸泡感染柱状黄杆菌的第4 d,在肝脏、脾脏、头肾中,注射组的白介素1(IL-1)、组织相容性复合体I(MHC I)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的m RNA表达水平显著提高;短链五聚素(PTX)在草鱼的肝脏中,表达无显著差异;在感染第4 d,PTX在脾和头肾中的表达量显著提高;四个基因在体肾的表达变化呈现不同的规律。该结果表明,柱状黄杆菌产生的EPS可以加强机体的炎症反应、体液免疫和抗原提呈能力。结果表明:柱状黄杆菌的EPS能够增强草鱼对柱状黄杆菌的抵抗力,提高草鱼的免疫应答水平。EPS注射后的草鱼,在柱状黄杆菌感染时可产生和分泌更多的AKP、SOD。EPS可以使IL-1、MHC I、PTX和TNF-α等免疫相关基因表达量升高,增强草鱼的免疫功能,显著提高草鱼的存活率。