论文部分内容阅读
鸡卵巢在生殖系统是一个独特的、动态的器官，组织发育和重塑的程度迅速而广泛，并周期性地重复，而且卵巢的发育及排卵同样受到卵泡内膜细胞、颗粒细胞(Granulosa Cells，GCs)等相关分泌因子的共同调节。组织因子途径抑制剂-2(Tissue factor path way inhibitor-2，TFPI2)最初是从人胎盘组织中分离出来的30-36kDa糖蛋白。早期的研究发现它在胎盘、精浆、精囊和卵泡液中大量存在，并且可以影响细胞外基质(Extracellular Matrix)金属蛋白酶(MMPs)使组织的重塑受到影响，这表明TFPI2在动物生殖发育过程中发挥着重要作用，但其在鸡卵巢GCs中的表达调控尚不清楚。根据前期项目组对预产期(15W)、产蛋前期(20W)、产蛋高峰期(30W)、产蛋后期(68W)海兰褐蛋鸡不同生理阶段卵巢组织的RNA-seq数据，发现TFPI2基因在繁殖期不同生理阶段表达差异显著，因此本研究主要以海兰褐蛋鸡为研究对象，对TFPI2基因进行分子生物学研究，并探讨了TFPI2在性成熟鸡不同发育状态卵泡中的表达模式及其在卵巢GCs中的调控及功能研究等。主要获得以下研究结果:
试验一TFPI2基因组织表达分析及全长克隆、序列的生物信息学分析
通过qRT-PCR技术进行了数据验证，结果与RNA-seq数据保持一致;组织表达结果表明TFPI2基因在卵巢组织中高表达。利用RACE技术获得了TFPI2基因的全长序列，包括5非翻译区(5 UTR)长55bp、3非翻译区(3UTR)长975bp、蛋白质编码区(CDS)长720bp、可编码240个氨基酸残基;系统进化树表明TFPI2在禽类中比较保守。
试验二TFPI2在性成熟蛋鸡卵巢不同发育状态卵泡中的表达与分布定位
利用qRT-PCR技术检测了TFPI2mRNA在不同等级卵泡的表达，结果显示，在不同卵泡颗粒层和膜层中TFPI2mRNA在颗粒层表达显著高于膜层(P＜0.05)，且TFPI2mRNA在卵泡选择前4-6mm和9-12mm颗粒层差异显著(P＜0.05);在排卵后(POF)卵泡中，TFPI2mRNA在POF2-POF5中表达逐渐增加;在健康卵泡和闭锁卵泡中，TFPI2mRNA在健康卵泡中的表达显著高于闭锁卵泡(P＜0.05)。成功制备TFPI2蛋白的多克隆抗体后通过WesternBlot检测了TFPI2蛋白在不同发育状态卵泡中的表达，发现等级前卵泡中TFPI2蛋白在颗粒层表达高于膜层;细胞免疫荧光结果表明，TFPI2蛋白定位于胞浆中;免疫组化结果表明，TFPI2定位于卵巢基质，原始卵泡，6-8mm和F1的卵泡膜层和颗粒层，排卵后卵泡、健康和闭锁卵泡基质细胞中。
试验三TFPI2对鸡卵巢颗粒细胞功能调控研究
为了研究TFPI2生物学功能及其表达调控机制，本试验成功构建了含有目的基因TFPI2的过表达载体TFPI2-pcDNA3.1-EGFP，同时根据TFPI2基因CDS序列，设计siRNA干扰片段。在等级前颗粒细胞(Prehierarchical granulosa cells，PhGCs)中过表达TFPI2发现，可显著降低标志基因促性腺激素受体(FSHR)的表达(P＜0.05)，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，抑制金属蛋白酶(MMPs)的表达。在等级颗粒细胞(Preovulatory granulosa cells, PoGCs)中过表达TFPI2发现可显著降低标志基因FSHR的表达(P＜0.05)，且对细胞增殖、凋亡基因和MMPs无影响。但是TFPI2过表达在PhGCs和PoGCs均能显著降低类固醇激素的合成(P＜0.05)。选用项目组前期对河南省地方蛋鸡(固始蛋鸡)28W，36W，43W产蛋高峰期高产组和低产组，检测了TFPI2在其卵巢中的表达，结果表明，在28WTFPI2mRNA表达在低产组显著高于高产组(P＜0.05)，在36WTFPI2mRNA表达在低产组极显著高于高产组(P＜0.01)，在43WTFPI2mRNA表达在低产组高于高产组，但差异不显著。
试验四外源激素(FSH/LH)处理鸡卵巢颗粒细胞对TFPI2基因表达调控影响
通过外源添加促卵泡素(FSH)和黄体生成素(LH)(剂量:0、5、10、25、50、100ng/ml)24h后，FSH可以显著促进PhGCs和PoGCs中TFPI2基因和蛋白的表达(P＜0.05)，但不存在剂量依赖性;选用中间浓度25ng/ml在不同时间梯度(3、6、12、24h)处理GCs，结果发现在PhGCsTFPI2mRNA的表达先升高(6h最高)后降低，在PoGCs中无规律变化;LH处理PhGCs可以显著抑制TFPI2基因和蛋白的表达(P＜0.05)，而在PhGCs中可以显著促进TFPI2基因和蛋白的表达(P＜0.05);选用中间浓度(25ng/ml)在不同时间梯度处理GCs，发现在PhGCs和PoGCs中TFPI2mRNA的表达先升高(6h最高)后降低。选用中间浓度(25ng/ml)FSH+LH共处理PhGCs24h后发现对TFPI2mRNA表达没影响，在PoGCs可以显著促进TFPI2mRNA的表达(P＜0.05)，而在PhGCs和PoGCs不同时间梯度对TFPI2mRNA的表达先升高(6h最高)后降低。FSH单独以及FSH+LH共处理GCs可以促进类固醇激素合成相关基因的表达(STAR、CYP17A1、CYP11A1、3B-HSD等)。此外，采用抑制剂进行阻断分析，发现FSH和LH可以通过诱导不同的通路(PKA，PKC，PI3K和mTOR等)来调节TFPI2基因的表达。
以上结果表明，TFPI2在不同卵泡均有表达，主要的作用靶点在GCs，可通过调控鸡卵泡GCs的增殖分化，以及类固醇激素的合成和降低ECM的溶解进而影响卵泡发育，此外，FSH和LH激素可以诱导不同的通路来调控TFPI2的表达，这些研究结果为明确TFPI2基因在鸡卵泡发育过程以及卵泡发育成熟和排卵的分子调控机制提供了理论和试验依据。
试验一TFPI2基因组织表达分析及全长克隆、序列的生物信息学分析
通过qRT-PCR技术进行了数据验证，结果与RNA-seq数据保持一致;组织表达结果表明TFPI2基因在卵巢组织中高表达。利用RACE技术获得了TFPI2基因的全长序列，包括5非翻译区(5 UTR)长55bp、3非翻译区(3UTR)长975bp、蛋白质编码区(CDS)长720bp、可编码240个氨基酸残基;系统进化树表明TFPI2在禽类中比较保守。
试验二TFPI2在性成熟蛋鸡卵巢不同发育状态卵泡中的表达与分布定位
利用qRT-PCR技术检测了TFPI2mRNA在不同等级卵泡的表达，结果显示，在不同卵泡颗粒层和膜层中TFPI2mRNA在颗粒层表达显著高于膜层(P＜0.05)，且TFPI2mRNA在卵泡选择前4-6mm和9-12mm颗粒层差异显著(P＜0.05);在排卵后(POF)卵泡中，TFPI2mRNA在POF2-POF5中表达逐渐增加;在健康卵泡和闭锁卵泡中，TFPI2mRNA在健康卵泡中的表达显著高于闭锁卵泡(P＜0.05)。成功制备TFPI2蛋白的多克隆抗体后通过WesternBlot检测了TFPI2蛋白在不同发育状态卵泡中的表达，发现等级前卵泡中TFPI2蛋白在颗粒层表达高于膜层;细胞免疫荧光结果表明，TFPI2蛋白定位于胞浆中;免疫组化结果表明，TFPI2定位于卵巢基质，原始卵泡，6-8mm和F1的卵泡膜层和颗粒层，排卵后卵泡、健康和闭锁卵泡基质细胞中。
试验三TFPI2对鸡卵巢颗粒细胞功能调控研究
为了研究TFPI2生物学功能及其表达调控机制，本试验成功构建了含有目的基因TFPI2的过表达载体TFPI2-pcDNA3.1-EGFP，同时根据TFPI2基因CDS序列，设计siRNA干扰片段。在等级前颗粒细胞(Prehierarchical granulosa cells，PhGCs)中过表达TFPI2发现，可显著降低标志基因促性腺激素受体(FSHR)的表达(P＜0.05)，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，抑制金属蛋白酶(MMPs)的表达。在等级颗粒细胞(Preovulatory granulosa cells, PoGCs)中过表达TFPI2发现可显著降低标志基因FSHR的表达(P＜0.05)，且对细胞增殖、凋亡基因和MMPs无影响。但是TFPI2过表达在PhGCs和PoGCs均能显著降低类固醇激素的合成(P＜0.05)。选用项目组前期对河南省地方蛋鸡(固始蛋鸡)28W，36W，43W产蛋高峰期高产组和低产组，检测了TFPI2在其卵巢中的表达，结果表明，在28WTFPI2mRNA表达在低产组显著高于高产组(P＜0.05)，在36WTFPI2mRNA表达在低产组极显著高于高产组(P＜0.01)，在43WTFPI2mRNA表达在低产组高于高产组，但差异不显著。
试验四外源激素(FSH/LH)处理鸡卵巢颗粒细胞对TFPI2基因表达调控影响
通过外源添加促卵泡素(FSH)和黄体生成素(LH)(剂量:0、5、10、25、50、100ng/ml)24h后，FSH可以显著促进PhGCs和PoGCs中TFPI2基因和蛋白的表达(P＜0.05)，但不存在剂量依赖性;选用中间浓度25ng/ml在不同时间梯度(3、6、12、24h)处理GCs，结果发现在PhGCsTFPI2mRNA的表达先升高(6h最高)后降低，在PoGCs中无规律变化;LH处理PhGCs可以显著抑制TFPI2基因和蛋白的表达(P＜0.05)，而在PhGCs中可以显著促进TFPI2基因和蛋白的表达(P＜0.05);选用中间浓度(25ng/ml)在不同时间梯度处理GCs，发现在PhGCs和PoGCs中TFPI2mRNA的表达先升高(6h最高)后降低。选用中间浓度(25ng/ml)FSH+LH共处理PhGCs24h后发现对TFPI2mRNA表达没影响，在PoGCs可以显著促进TFPI2mRNA的表达(P＜0.05)，而在PhGCs和PoGCs不同时间梯度对TFPI2mRNA的表达先升高(6h最高)后降低。FSH单独以及FSH+LH共处理GCs可以促进类固醇激素合成相关基因的表达(STAR、CYP17A1、CYP11A1、3B-HSD等)。此外，采用抑制剂进行阻断分析，发现FSH和LH可以通过诱导不同的通路(PKA，PKC，PI3K和mTOR等)来调节TFPI2基因的表达。
以上结果表明，TFPI2在不同卵泡均有表达，主要的作用靶点在GCs，可通过调控鸡卵泡GCs的增殖分化，以及类固醇激素的合成和降低ECM的溶解进而影响卵泡发育，此外，FSH和LH激素可以诱导不同的通路来调控TFPI2的表达，这些研究结果为明确TFPI2基因在鸡卵泡发育过程以及卵泡发育成熟和排卵的分子调控机制提供了理论和试验依据。