上皮—间充质转化与卵巢癌化疗耐药关系研究

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化疗耐药是临床上治疗肿瘤的关键障碍之一。卵巢癌是影响女性生存的恶性肿瘤之一,在临床治疗中,紫杉醇作为其治疗的一线药物,但由于发生耐药而降低其疗效。因此深入研究耐药发生机制尤为重要。本论文将从上皮间充质转化(EMT)与肿瘤干细胞的角度解释耐药性状发生及对细胞功能的改变,力求寻找出一条可调控卵巢癌细胞耐药发生的信号通路。本课题以人卵巢癌细胞野生株(A2780/WT)和紫杉醇耐药株(A2780/PTX)为模型,通过药敏性检测,其对紫杉醇IC50分别为34.17μmol·L-1和76.06μmol·L-1; RT-PCR和免疫细胞荧光法检测EMT相关标志蛋白在两株细胞中的表达,结果显示A2780/PTX细胞与A2780/WT细胞相比,形态上由铺路石状转变成梭形,EMT相关分子标志物发生明显改变,上皮细胞标志物E-cadherin和Laminin5表达显著下调,间质细胞标志物N-cadherin和Vimentin表达显著上调。细胞划痕及Transwell结果证明A2780/PTX细胞迁移能力增强,功能上改变与EMT的变化相符。这为选择卵巢癌耐药细胞株作为模型研究EMT与耐药发生机制探讨奠定基础。由于PI3K/Akt作为EMT发生信号通路,在多种肿瘤中均被激活。对A2780/PTX细胞添加PI3K/Akt抑制剂LY294002处理,采用MTT、RT-PCR、免疫细胞荧光染色、Transwell等方法,进行耐药指数检测、EMT标志物、细胞迁移及骨架结构改变等方面评价EMT的发生与肿瘤恶性程度的关系。结果表明:经过抑制剂LY294002处理,细胞发生EMT标志物逆转,迁移能力减弱,细胞对紫杉醇IC50下降为22.90μmol·L-1,同时细胞骨架结构排布向野生型骨架结构靠拢。这一结果表明,EMT的发生促进肿瘤细胞发生耐药,增加肿瘤恶性程度;通过逆转EMT的发生,可以增加对化疗药物敏感性,降低肿瘤恶性程度。进一步比较了野生型细胞(A2780/WT)与耐药型细胞(A2780/PTX)两株细胞中肿瘤干细胞标志物ALDH1表达情况和体外软琼脂克隆形成试验评价两株细胞的体外肿瘤形成能力。结果显示:耐药细胞高表达ALDH1,且其体外克隆形成能力明显高于野生型细胞。这一结果表明,耐药细胞发生EMT后,富集了肿瘤干细胞样细胞,增强其耐药并增加肿瘤形成能力。本论文首次证明了耐紫杉醇人卵巢癌细胞通过PI3K通路介导EMT的发生,参与耐药性状的增强及迁移能力的增加,通过逆转EMT的发生,可以降低耐药及其恶性行为,但PI3K通路中具体的调控靶点还有待进一步研究。
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