香椿多酚氧化酶特性及褐变调控方法研究

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香椿是中国特有的木本蔬菜,香气浓郁,且富含多种营养成分,但香椿在其采摘后的加工贮藏过程中易发生褐变,严重影响其产品的外观、风味以及营养价值。多酚氧化酶(PPO)是导致果蔬产品褐变的主要酶类,目前有关香椿PPO的研究还未见报道。因此,为控制香椿产品的酶促褐变,保护其感官质量和营养品质,本研究以香椿嫩芽为原料,采用现代分离纯化技术提取香椿PPO,探讨其酶学特性;分析不同生长期香椿抗氧化活性及PPO同工酶的变化;研究加工处理对香椿PPO活力、褐变度等的影响。主要研究结果如下:香椿PPO经25-70%(NH4)2SO4分级沉淀和Sephacryl S-100柱层析纯化后,得到香椿PPO比活力为900.62U/mg蛋白。经SDS-PAGE电泳检测,纯化后的香椿PPO达到电泳纯,其相对分子量为84.55 kDa。以儿茶酚和焦性没食子酸为底物,香椿PPO最适温度和最适pH值分别为40℃和6.2、80℃和8.5,且分别在pH5.0-7.2和7.4-9.5范围内PPO活力强且稳定性高;反应活化能(△Ea#)分别为263.79 KJ/mol和103.91KJ/mol;在65-80℃范围内,香椿PPO活力降至其最高活力一半时所需的时间(即t1/2值)分别为51.10-0.84min和25.17-5.57min,D值分别为169.82-2.81min和83.65-18.10min。热力学研究表明,香椿PPO与焦性没食子酸反应时耐热性更强。在温度低于75℃时,香椿PPO与上述两个底物反应其活力均较强,但超过75℃其活力明显下降。香椿PPO底物特异性研究表明,Vm/Km值分别为0.0151(儿茶酚)、0.0543(焦性没食子酸)和0.0053(没食子酸),其中焦性没食子酸为最适底物,没食子酸甲酯和表儿茶素不与香椿PPO反应。在选取的香椿PPO化学抑制剂中以亚硫酸盐抑制效果最佳,抗坏血酸、L-半胱氨酸和柠檬酸次之,苯甲酸钠、十二烷基磺酸钠(SDS)和EDTA-2Na抑制效果均较弱。Na+、Ca2+和Al3+均对PPO活力无显著抑制效果,Cu2+与Fe3+均使PPO活力增强。三种天然提取物中,以紫洋葱皮提取物对PPO活力的抑制效果最佳,石榴皮提取物次之,板栗壳提取物无抑制效果,且以儿茶酚或焦性没食子酸为底物时,石榴皮提取物和紫洋葱皮提取物对香椿PPO活力的半抑制浓度(IC50)分别为5.19mg/mL和3.69mg/mL、3.36mg/mL和 2.78mg/mL。不同生长期香椿抗氧化活性以第三生长期最强,其次是第二和第一生长期,且与酚性成分呈量效关系;PPO活力以第一生长期香椿最强,其次是第三和第二生长期;三个生长期香椿的总酚含量均呈显著递增趋势(p<0.05);总黄酮含量以第一生长期最低,第二与第三生长期总黄酮含量差异不显著(p>0.05);三个生长期香椿的亚硝酸盐含量呈显著递减趋势(p<0.05)。不同生长期香椿PPO共分离出5条谱带(A1-A5),其中A3和A4为PPO特征谱带。香椿PPO同工酶谱中A1、A2和A5在不同生长期的动态变化导致了各生长期香椿PPO活力的差异,其中谱带A5对PPO活力影响最大,其次是谱带A1和 A2。香椿嫩芽在90℃蒸馏水中烫漂90s,其PPO相对活力可降至24.95%,达到较好的抑制香椿PPO活力的效果。而在烫漂水中各加入亚硫酸钠、抗坏血酸和L-半胱氨酸,于90℃条件下烫漂60s,香椿PPO相对活力均降至22%以下,香椿褐变度值亦明显降低,且以亚硫酸钠的效果最佳,其次是抗坏血酸,L-半胱氨酸次之,加入抑制剂后可显著缩短烫漂时间并对香椿PPO活力及褐变度达到较好的抑制效果。在香椿烫漂处理中,可选择0.05g/100g Vc和0.10g/100g亚硫酸钠作为香椿烫漂工序中的复合抑制剂,该复合抑制剂可使香椿褐变度大大降低,达到较好的护色效果。
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