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第一部分Sirt6对多壁碳纳米管和TGF-β1诱导的上皮间质转化的作用目的:Sirt6是组蛋白去乙酰化酶Ⅲ家族的一员,在代谢、衰老、癌症等人体重要的生理过程中发挥重要作用,但Sirt6是否调控上皮间质转化(Epithelial to mesenchymal transition,EMT)表型尚不清楚。方法:雄性C57BL小鼠分为三组(空白对照组、多壁碳纳米管(Multi-walled carbon nanotube,MWCNT)组和博莱霉素组),每组10只小鼠。分别注射50 μ1生理盐水或60μg MWCNT处理56天或2 mg/kg博来霉素处理21天后,取肺组织进行免疫组化(Immunohistochemisty,IHC)染色和Western blot检测Sirt6的表达。A549 细胞过表达 Sirt6 后使用 16 μg/cm2 MWCNT 或 5 ng/ml TGF-β1(Transformed growth factor-beta 1)处理细胞 24 小时,采用 Western blot、Real-time PCR和免疫荧光检测EMT标志物E-cadherin、vimentin和α-SMA的表达。采用Western blot和Real-time PCR检测纤维化标志物FN、CTGF蛋白和mRNA的表达。此外,通过Transwell实验检测A549细胞的迁移能力改变。结果:(1)在MWCNT和博来霉素诱导的肺纤维化模型中,IHC染色和Western blot检测发现Sirt6表达上调(P<0.05);(2)过表达Sirt6可以逆转MWCNT和TGF-β1诱导的EMT表型(P<0.05);(3)过表达Sirt6显著抑制TGF-β1诱导的FN和CTGF蛋白和mRNA的表达(P<0.05)。同时A549细胞羟脯氨酸的分泌和细胞迁移能力受到抑制(P<0.05)。结论:过表达Sirt6可以显著抑制MWCNT和TGF-β 1诱导的EMT表型和TGF-β 1诱导的间质细胞学行为。第二部分过表达Sirt6对上皮间质转化调控的机制研究目的:进一步研究过表达Sirt6对EMT的调控机制。方法:在A549细胞中过表达Sirt6,使用5 ng/ml TGF-β1刺激60分钟或者24小时。通过Western blot检测TGF-β/Smads通路分子的表达变化。免疫荧光技术检测Smad3的核转位和与Sirt6的共定位。免疫共沉淀分别检测Sirt6与Smad3或者与snail 1结合情况以及Smad3和snail 1的结合变化。Real-time PCR检测EMT相关转录因子(snail1、slug、twist1、ZEB1和ZEB2)mRNA的表达变化。结果:(1)过表达Sirt6显著削弱TGF-β1的蛋白表达(P<0.05),但对Smad2、Smad3和Smad4蛋白表达无影响;(2)过表达Sirt6显著抑制Smad3磷酸化以及核转位(P<0.05),但对Smad2磷酸化没有影响;(3)随着TGF-β1刺激时间增加,Sirt6与Smad3或snail 1的结合也随之增加。此外,过表达Sirt6阻碍TGF-β1诱导的snail1和Smad3的结合;(4)过表达Sirt6显著抑制TGF-β1诱导的EMT相关转录因子的表达(P<0.05或P<0.01)。结论:Sirt6可能通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路调节EMT表型;Sirt6抑制EMT相关转录因子可能是其调控EMT的一种机制。第三部分肺靶向过表达Sirt6削弱博来霉素诱导的上皮间质转化和肺纤维化目的:动物体内进一步验证Sirt6对EMT的调控作用。方法:C57BL小鼠分为四组(对照组、Sirt6过表达组、对照+博莱霉素组和Sirt6过表达+博莱霉素组),每组15只小鼠。每只小鼠肺部注射2×1011 vgSirt6腺相关病毒一周后,经气管插管注射2 mg/kg的博来霉素,21天后取肺组织做苏木精-伊红染色、Masson、IHC和免疫荧光染色。结果:(1)肺组织过表达Sirt6后,E-cadherin、vimentin和α-SMA IHC染色和proSPC、vimentin和α-SMA免疫荧光双染显示肺组织EMT表型被抑制;(2)苏木精-伊红染色后发现相比博来霉素组,组织损伤显著减轻;(3)Masson染色发现肺组织内胶原沉积减少;纤维化标志物FN和CTGF表达也同样减少。结论:过表达Sirt6在体内抑制EMT和肺纤维化。