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目的：HIF-1与胰腺癌生物学行为密切相关。前期研究结果提示HIF-1α与CypA的表达存在相关性,二者之间可能存在调控关系。本研究旨在探讨HIF-1与CypA的调控关系；CypA对胰腺癌生物学行为的影响及机制；CypA与HIF在胰腺癌病理组织中表达的相关性及CypA表达对胰腺癌病人预后的影响。方法：第一部分：HIF-1α与CypA的关系用Si-RNA-HIF-1α干扰胰腺癌细胞株BXPC-3HIF-la表达、pc-DNA3.0-HIF-1α或低氧培养使MIA-paca-2细胞过表达HIF-1α。采用染色体免疫共沉淀技术确定HIF-1α与CypA启动子结合方式,定量PCR, western blot验证CypA与HIF-1α的mRNA及蛋白表达,观察抑制或过表达HIF-1α后CypA的表达。第二部分：CypA对胰腺癌细胞生物学行为影响及机制用Si-RNA-HIF-1a转染胰腺癌细胞株BXPC-3抑制HIF-1α、CypA的表达；pc-DNA3.0-HIF-1α转染MIA-paca-2细胞过表达HIF-la,并通过给予抑制剂(2ME, CsA)抑制HIF-1α及CypA的表达,采用划痕试验、Transwell小室法观察对比两种情况下细胞迁移能力；流式细胞术检测细胞周期改变及凋亡情况；MTT检测两种情况下细胞增殖能力变化；PCR、Western blot、免疫荧光方法对比两种情况下细胞HIF-la, CypA, NFKB, ERK1/2, p-ERK1/2, P53的表达。第三部分：体内验证HIF-1α及CypA信号通路对肿瘤生长的影响选取BALB/c裸鼠,制成胰腺癌皮下移植瘤模型,随机分为4组,对照组：3只,饲喂生理盐水；2ME组：4只,饲喂2ME (2-methoxyestradiol,2ME,二甲氧雌二醇)；CsA组：4只,饲喂CsA (Cyclosporin A, CsA,环孢霉素A)；2ME+CsA组：5只,饲喂2ME+CsA。待肿瘤生长至5mm,每周2次给药,连续2周,间隔1周为1周期,共行3周期。给药结束后处死试验动物并完整获取肿瘤组织、肝、肾组织,测量肿瘤大小及重量,免疫组化,检测各组HIF-1α、CypA、NFkB、ERK1/2. P53的表达。第四部分：HIF-1α与CypA在胰腺癌组织标本中的表达相关性及CypA对患者预后的影响取胰腺癌病人根治术后的组织标本79例,采用免疫组织化学染色检测HIF-1α、CypA的表达；Spearman法进行统计分析,对患者进行随访,Kaplan-Merier法绘制生存曲线,行生存分析结果：第一部分：HIF-1α与CypA的关系染色体免疫共沉淀技术显示：HIF-1a与CypA启动子前-77bp处的第二位HRE相结合,而不能结合第一位和第三位HRE。定量PCR:BXPC-3细胞转染Si-RNA,干扰HIF-1α后,HIF-1αmRNA的表达下降,CypA的mRNA表达也下降；MIA-paca-2细胞系过表达HIF-1α后,HIF-1α与CypA的mRNA表达均升高,干扰CypA的表达后HIF-1α表达升高。MIA-paca-2细胞低氧培养(1%02),1h及3h时间点HIF-1α与CypA mRNA的表达均升高,p<0.05。Western blot:与MIA-paca-2细胞相比HIF-1α在BXPC-3细胞中呈高表达,CypA蛋白在BXPC-3中的表达高于MIA-paca-2细胞,二者比值为1.58,HIF-1α及CypA的表达在低氧1h及3h均上升,与对照组比较,HIF-1α升高为2.062,4.739倍；CypA升高为2.058,20.833倍。BXPC-3细胞干扰HIF-1α后,HIF-1α表达下降,CypA的表达亦下降,减低倍率分别为0.559,0.187。MIA-paca-2细胞过表达HIF-1α后,HIF-1α的表达上升,CypA的表达也上升,升高倍率分别为3.22,1.88。第二部分：CypA对胰腺癌细胞生物学行为影响及机制探讨划痕实验显示：BXPC-3细胞转染siRNA-HIF-1α或siRNA-CypA后0h、6h、12h、24h划痕间距。至24h,对照组较干扰HIF-1α及CypA组划痕间距大,p<0.05。给BXPC-3细胞2ME、CsA或两者联合后0h、6h划痕间距在各组间均无统计学差异(p>0.05)；12h,CsA组与2ME+CsA且划痕间距较对照组大(p<0.05)；24h,2ME+CsA组细胞划痕间距大于低于单药组及对照组(p<0.05)。Transwell结果显示：干扰HIF-1a与CypA后12h,24h穿过膜的细胞数没有统计学差异,48h干扰组穿膜细胞数明显少于对照组(p<0.05)。干扰HIF-1α,CypA的表达后,OD值低于对照组；6h,12h,48h三给药组穿膜细胞均明显少于对照组(p<0.05)。2ME+CsA组穿膜细胞数量最少(p<0.01)。结晶紫染色OD值给药组均较对照组明显减低,p<0.05。MTT显示：,024h干扰组与未干扰组相比无统计学差异(p>0.05)；48h—72h,干扰HIF-1α与CypA组的OD值较对照组减低,p<0.05。三给药组OD值均降低,联合用药组OD值最低,两药物存在协同作用,协同指数为0.58。流式细胞术显示：与对照组相比,2ME组细胞凋亡百分比稍有增加但统计学无明显差异(p>0.05),CsA组增加较为明显,p<0.05,药物联合组凋亡增加明显,达到细胞总数的21.5%,与对照组及单药组比较差异有统计学意义(p<0.05)。干扰HIF-1α,CypA后,细胞的凋亡百分比增加；单独干扰CypA与HIF-1α组间差异无统计学意义(p>0.05),仅当共转染两种蛋白的Si-RNA,与单独干扰组相比差异有统计学意义(F=4.997,p<0.05)。给予BXPC-3细胞抑制HIF-1α及CypA的表达后,细胞周期改变不明显,各细胞周期均无统计学差异(F=0.599,p>0.05)。定量PCR显示：干扰Si-RNA-HIF-1α及CypA与对照着相比,ERK. NFkB的mRNA表达减低(p<0.05)；2ME组与对照组相比,ERK的表达下降(p<0.05),但NFkB, P53, ERK的1mRNA表达均无统计学差异(p>0.05)；CsA组与对照组相比,ERK、NFkB的(?)nRNA表达减低(p>0.05)；2ME+CsA组与对照组相比,CypA, HIF-1α的：mRNA表达均下降,P53的mRNA表达升高,为对照组4.2倍(p<0.01)。半定量PCR显示：2ME组与对照组相比,MMPs的mRNA表达均无明显变化；CsA组MMPs的表达下降(p<0.05)；2ME+CsA组,MMP3与MMP9减少(p<0.05)。干扰HIF-1α后,MMP3的mRNA表达减少；干扰CypA后,MMP2/3的mRNA表达均减少(p<0.05)。Western blot:干扰HIF-1α与对照组相比,CypA的蛋白表达下降,而P53的蛋白表达增加。ERK1/2及磷酸化ERK、NFkB的表达下降,2ME组,HIF-1α及CypA蛋白的表达为对照组的0.21、0.11倍,P53的蛋白表达增加,NFkB, p-ERK1/2, ERK1/2的蛋白表达在各给药组均比对照组减少,差异有统计学意义。免疫荧光技术结果：对照组与CsA组相比HIF-1α的蛋白表达相近,细胞核与细胞浆中均有明显表达；与对照组相比,2ME组和2ME+CsA组细胞核中HIF-1α的蛋白表达下降。各给药组与对照组相比CypA的蛋白表达下降,2ME+CsA组下降最为明显。与对照组相比,2ME、CsA、2ME+CsA组P53的蛋白表达逐渐增高,NFkB,ERK1/2表达减少,在2ME+CsA组ERK1/2(?)勺蛋白几无表达。第三部分：HIF-1α及CypA信号通路对肿瘤生长的影响2ME组与CsA组小鼠死亡各一只,2ME+CsA组死亡两只。2ME组、CsA组及2ME+CsA组小鼠肿瘤体积较对照组均明显减小,尤以2ME+CsA组为著,肿瘤体积缩小达一半,比单药组肿瘤缩小更明显,p<0.05。死亡小鼠出现明显的肝细胞脂肪变和肾间质出血。免疫组化染色：HIF-1α与CypA的蛋白表达较对照组下降,且药物联合组,HIF-1α与CypA的蛋白表达下降更明显；P53蛋白在2ME+CsA组表达较对照组及单药组高；与对照组相比,ERK1/2及NFkB的蛋白表达减低(>70%),在2ME+CsA组表达最少(<5%)。第四部分：HIF-1α与CypA在胰腺癌组织标本中的表达相关性及对患者预后的影响免疫组化显示：HIF-1α与CypA的蛋白表达相关,相关系数为0.584,p<0.001。HIF-1α与TNM分期相关(p=0.035),与其他临床特点无关；CypA的表达与肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移情况以及CA199的表达水平相关(p<0.05)；CypA表达阴性患者共18例,中位生存期为19个月,表达阳性患者共61例,中位生存期为9个月,两组比较有统计学差异,p<0.05。结论：1.HIF-1α可通过与CypA启动子区第二位HRE结合调节CypA的表达。2.HIF-1α与CypA的表达增高可增加细胞增殖、浸润及转移能力,抑制剂2ME及CsA可通过上调P53的表达诱导胰腺癌细胞凋亡,通过抑制ERK1/2/NFkB/MMP2,3,9的表达而抑制胰腺癌细胞的增殖、浸润及转移能力。3.CsA与2ME可抑制移植瘤小鼠肿瘤的增生,二者联合应用的效果更加明显,但可导致致命性肝肾功能损害。4.胰腺癌病人中,HIF-1α与CypA的表达具有相关性,CypA的表达与肿瘤大小,TNM分期,淋巴结转移及CA199的表达相关；CypA表达阳性者患者预后不良。