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类金属元素砷(As)在医药、工业、矿业及农业等方面的广泛应用严重污染了地下水和土壤等生态环境,并威胁着人类的健康。近年来,利用微生物、植物及二者协同作用的生物修复法因其潜在的高效、经济和环保的优势而具有很好的应用前景。同时,抗砷细菌的筛选和抗砷机制的研究也成为国内外学者的研究热点之一。本研究以分离自湖南铅锌矿区土壤的44株抗砷细菌为研究对象,旨在进一步筛选得到抗高浓度砷的菌株,并对优势菌株进行生理生化特征、抗砷基因、砷氧化还原能力、植物促生能力等方面的测定,最终确定一个目标菌株进行全基因组测序,分析其抗砷基因簇和抗其他重金属的基因。主要的研究内容和结果如下所示: (1)利用含有不同浓度Na2HAsO4·7H2O和NaAsO2的LB固体培养基对44株抗砷菌株进行进一步筛选,最终得到13株高抗砷菌株,其对As5+和As3+的耐受性分别可高达800 mmol/L和20 mmol/L。用平板法检测到这些菌株对其他的重金属也有不同程度的抗性。 (2)经16S rDNA系统发育分析,这13株高抗砷菌株分属于三个门:厚壁菌门,变形菌门和放线菌门;八个不同的属:芽孢杆菌属,威廉氏菌属,柠檬球菌属,红球菌属,节杆菌属,苍白杆菌属,假单胞菌属,鞘氨醇单胞菌属。经过相关抗砷基因的AT克隆检测,其中11株高抗砷菌株中至少存在一个抗砷基因,但是根据所用扩增引物,没有检测到砷甲基化酶基因和氧化酶基因。 (3)用砷钼蓝法对抗砷菌株的氧化和还原能力定量分析结果显示,13株细菌均表现出了不同程度的氧化还原能力,在72 h内对1mmol/L的As3+和As5+的氧化率和还原率的范围分别为5%-30%和10%-51.2%,其中Bacillus sp.Tw1和Pseudomonas sp.Tw224在120 h时对As3+的氧化率达到最大值,分别为42.48%和34.94%; Pseudomonassp.Tw224和Bacillus sp.Tw133对As5+的还原率最高分别可达52.01%和48.66%;因此将Tw1、Tw133和Tw224这三株菌确定为优势菌株,进行下一步研究。 (4)三株优势菌Tw1、Tw133和Tw224产植物生长激素吲哚乙酸(IAA)分别达到1.81μg/mL,42.86μg/mL和24.36μg/mL,且Tw133和Tw224明显促进小麦的生长,表现为对小麦的根长、苗高、鲜重和干重提高了约20%-35%;利用API试剂盒分析了上述三株优势菌株生理生化特性,初步了解了其代谢特征和遗传背景。 (5)通过全基因组测序和生物信息学分析,菌株Tw224基因组上不但含有两个抗砷基因簇ars1(arsH-arsC-arsB-arsR)和ars2(arsC-arsB-arsR),其主要介导As5+的还原机制,还含有多个抗其他重金属的基因或基因簇(如cop、czc、Nik、Mer等系统),且存在着植物生长素IAA生物合成的trp操纵子。 本研究内容为深入研究砷的代谢机制提供了丰富的菌株和基因资源,也为砷污染环境的生物修复奠定了理论基础。