蝙蝠种类多,分布广泛,与人类接触密切,是一些重要动物源性疾病的传染源。迄今为止,已在蝙蝠体内分离或者检测到就有70多种病毒。因此,研究蝙蝠携带病毒的种类以及对人可能的危害很有必要。传统的研究方法对于核酸信息未知的病毒往往束手无策,随着分子生物学技术的发展及挖掘新病毒的需求增大,一些不依赖于已知核酸序列研究病毒的方法不断出现,其中一种基于高通量测序的病毒宏基因组学方法越来越成熟。对海量高通量测序数据进行分析是一种挑战,很多实验动辄产生几个TB的数据量,但因为处理能力和存储能力的不足,研究者不得不把绝大部分未经处理的数据丢弃掉或仅做初步分析,对高通量测序数据的深入验证分析仍然是一个难点。近五年来已有5份关于蝙蝠病毒宏基因组学的研究,其中2份研究来自美国,3份来自中国。这5份研究通过454测序或者Solexa测序,发现了大量的蝙蝠新病毒,大大的加深了人们对蝙蝠携带病毒多样性的了解,但是研究蝙蝠种类和数量非常有限。本课题组自2006年在广东、海南、湖南等地蝙蝠携带病毒进行流行病学调查,发现了这些地区的一些蝙蝠能携带一些人类传染病病毒,但逐个病毒检测工作量巨大,也受到常规检测方法敏感性的影响,而且不能发现未知的病毒。因此本研究拟建立基于Solexa高通量测序的蝙蝠组织病毒宏基因组学分析方法,对来自广东的1只大足鼠耳蝠和来自海南的1只长翼蝠的脑、血清以及直肠部位的病毒群落进行探索,以期发现蝙蝠携带的可能与人有关的已知和未知病毒;此外,通过基于高通量测序结果,对蝙蝠样品中的几种重要病毒进行初步验证研究,并开展蝙蝠样本相关病毒的分子流行病学调查。1研究方法1.1蝙蝠标本的采集在广东、海南和湖南部分地区捕捉蝙蝠,进行编号后,请广州大学生命科学院蝙蝠研究专家吴毅教授进行鉴定。通过无菌操作解剖蝙蝠,取完整脑组织和肠道近肛门段标本,用无菌注射器心脏采血,每种组织一式两份。采集的脑、直肠样本存放于含200ulRNAlater储存液的冻存管中,心脏采血收集全血装于EP管中,置放于密封的冰袋泡沫盒中当天运回实验室,放于-80℃冰箱贮存,待检。1.2病毒宏基因组学方法1.2.1组织样本的准备将组织样本旋涡、离心后,收集组织病毒液进行去背景核酸处理,分别采用RNA和DNA病毒提取试剂盒提取病毒核酸后,进行cDNA和单链DNA的补平后混合,应用随机引物对混合病毒核酸进行随机扩增,对扩增产物进行检测后送样建库测序。1.2.2高通量测序由深圳华大基因公司完成,首先采用超声法Covaris将长片段PCR产物随机打断并产生主带小于等于800bp的一系列DNA片段,添加特殊接头后连接,并制成文库,随后应用四种荧光标记的核苷酸通过桥式PCR进行边合成边测序获得原始Reads数据。1.2.3病毒注释和丰度分析首先将获得的重叠序列使用BLASTn和BLASTx在GenBank的非冗余核苷酸序列数据库和美国能源部联合基因组研究所JGI数据库中进行比对,分别取Evalue<10-5或者nt>100的序列作为有意义的序列,然后按照物种注释信息,去除细菌及真核类等其他非病毒序列。1.3几种重要病毒的PCR扩增和初步序列分析在样本RNA提取、逆转录获得cDNA后。根据人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)、塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus,SFV)、人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)、甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,ScMV)标准序列和宏基因学分析近源参考株设计引物,根据引物特点摸索PCR反应条件,经琼脂糖电泳检测,可疑阳性PCR产物送公司测全序。将测序成功可疑病毒序列用GenBank的BLAST软件进行在线同源性分析,并从GenBank上下载其他相关病毒序列,利用ClustalW进行多序列比对分析。用MEGA4.0软件,采用Neighbor-Joining(邻近连接法),Jukes-Cantor模型做进化树分析,所得进化树用Bootstrap(1000 replicates)法进行检验。1.4蝙蝠狂犬病毒(Rabies virus,RV)的检测参照本课题组马莉珍等已建立的狂犬病毒RT-LAMP方法快速筛查蝙蝠脑组织样本,应用nested RT-PCR方法扩大样本检测蝙蝠脑组织狂犬病毒,以获得狂犬病毒序列,其中nested RT-PCR方法参考文献中引物,以狂犬病毒核蛋白(N)基因最保守区域为目的扩增基因。用狂犬病毒减毒活疫苗作为阳性对照,同时添加空白对照。1.5狂犬病毒N基因片段分析1.5.1狂犬病毒的细胞培养和乳鼠接种实验:将蝙蝠的脑组织悬液经滤器过滤后各取0.20ml接种于BHK-21细胞上,持续观察7天,并设正常细胞为空白对照,盲传3代以稳定毒力。每代培养7天后收取细胞病毒液,于-80℃冰箱中冻存。乳鼠接种狂犬病毒病毒,将可疑蝙蝠脑组织悬液经滤器过滤后,应用微量注射器于乳鼠右眼与右耳根方向连线中点前方2～3mm处接种2～3日龄NIH乳鼠,用疫苗株做阳性对照,DEPC水做阴性对照。观察时间持续14天,14天后所有未死亡实验动物均实行安乐死。无菌操作解剖取乳鼠脑组织保存于RNA later,置于-80℃冰箱。1.5.2狂犬病毒长片段核酸序列的获得和分析对于nested RT-PCR检测阳性样本和进行细胞培养和乳鼠接种的样本,应用较长目的序列片段的引物进行扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析,判定为阳性样本,送深圳华大公司测序。测序结果利用GenBank的BLAST软件进行在线同源性分析,并从GenBank上下载其他狂犬病毒序列,利用ClustalW进行多序列比对分析。用MEGA 4.0软件,采用Neighbor-Joining(邻近连接法),Jukes-Cantor模型做进化树分析,所得进化树用Bootstrap(1000 replicates)法进行检验。2结果2.1宏基因组分析样本、建库和测序结果应用病毒宏基因组学方法,分别构建了 1只大足鼠耳蝠(HZ47)脑组织是否培养2个文库和1只普通长翼蝠(HK69)脑组织、直肠、血清3个文库,Solexa技术分别对五个文库进行测序,测序结果Clean reads与GenBank病毒库进行比对,每个文库均有序列匹配到病毒。将Clean reads进行组装成Scaffold,每个文库均有Scaffold在JGI数据库中注释为病毒。2.2蝙蝠脑组织病毒悬液培养后K6样本宏基因组分析经过Solexa技术测序,从K6样本共获得原始测序数据量约为1,175Mb,获得 Clean reads 5,797,406 条,其中 0.15%(8408)的序列可经 GenBank 病毒库注释为病毒,病毒序列可以分为三类病毒:逆转录病毒、双链DNA病毒、单链RNA病毒,共包含9个科,主要匹配到反转录病毒科、多脱氧核糖核酸病毒科、疱疹病毒科、鱼类疱疹病毒。Scaffold经JGI数据库可注释多种病毒和噬菌体,其中 Enterobacteria phage lambda 注释长度为 1233 nt。2.3蝙蝠脑组织病毒悬液未培养K3样本宏基因组分析经过Solexa技术测序,从K3样本中共获得原始测序数据量约为1,083 Mb,获得Clean reads 5,071,276条,其中0.10%(5058)的序列可注释为病毒。病毒序列可分为四类病毒:逆转录病毒、双链DNA病毒、单链RNA病毒、双链RNA病毒,共包含13个科,主要匹配到反转录病毒科、多脱氧核糖核酸病毒科、疱疹病毒科、黄病毒科、微小核糖核酸病毒科、伴生豇豆病毒科、披衣病毒科。Scaffold经JGI数据库可注释病毒和噬菌体共35种,其中Enterobacteria phage lambda 注释长度为 1233 nt。其中 Enterobacteria phage lambda 注释长度 4705 nt,Murine leukemia virus 注释长度 1994 nt。2.4蝙蝠脑组织病毒悬液未培养K26样本宏基因组分析经过Solexa技术测序,从K26样本中共获得原始测序数据量约为1,826 Mb,获得Clean reads 8,864,191条,其中0.01%(513)的序列可注释为病毒。病毒序列可分为四类病毒(逆转录病毒、双链DNA病毒、单链RNA病毒、双链RNA病毒)和类病毒,共包含6个科,主要匹配到疱疹病毒科、黄病毒科、微小核糖核酸病毒科、马铃薯Y病毒科。Scaffold经JGI数据库可注释病毒和噬菌体共7种,其中ScMV注释长度4113 nt。2.5蝙蝠血清病毒悬液未培养K24样本宏基因组分析经过Solexa技术测序,从K24样本中共获得原始测序数据量约为1,470 Mb,获得Clean reads 6,632,091条,其中0.0048%(318)的序列可注释为病毒。病毒序列可分为四类病毒:逆转录病毒、双链DNA病毒、单链RNA病毒、双链RNA病毒、共包含7个科,主要匹配到微小核糖核酸病毒科、多脱氧核糖核酸病毒科、疱疹病毒科、披衣病毒科、反转录病毒科、黄病毒科。Scaffold经JGI数据库可注释病毒和噬菌体共9种,其中Enterobacteria phage P1 virion注释长度为770 nt。2.6蝙蝠直肠病毒悬液培养后K25样本宏基因组分析经过Solexa技术测序,从K25样本中共共获得原始测序数据量约为1,622Mb,获得 Clean reads 7,564,963 条,其中 0.0043%(322)的序列可注释为病毒。病毒序列可分为四类病毒:逆转录病毒、双链DNA病毒、单链RNA病毒、双链RNA病毒、共包含7个科,主要匹配到疱疹病毒科、微小核糖核酸病毒科最多,其中,能匹配到人类疱疹病毒58条,人类艾滋病毒36条,甘蔗花叶病毒15条。Scaffold经JGI数据库可注释病毒和噬菌体共17种,其中Enterobacteria phage P1 virion 注释长度为 771 nt。2.7重要病毒的初步分析2.7.1 HIV的PCR扩增和序列分析PCR扩增并且测序成功,获得序列一段,该序列进NCBI在线BLAST比对,发现该序列与毒株(GeneID:392790)具有100%同源性,但在测序成功的序列中为未找到HIV开放阅读框(open reading frame,ORF)。2.7.2人乳头状病毒的PCR扩增和序列分析根据人乳头状病毒标准株(GeneID:1489082)设计的两对引物,其中一对PCR扩增扩增成功,长度为846bp。根据开放阅读框L1,研究通过NCBI在线BLAST比对发现,该株与HQ644234株(GeneID:399525615)具有99%同源性,进行某基因的核苷酸进行进化树分析,结果显示该扩增序列与来自亚洲(HQ644234)株簇为一支。2.7.3塞姆利基深林病毒的核酸扩增和序列分析根据SFV标准株设计的引物,在10份样本中进行PCR扩增,琼脂糖电泳显示全部为阴性。根据上述SFV重组株设计的引物,在10份样本中进行PCR扩增,样本HZ1和HZ47琼脂糖电泳显示为阳性。HZ47样本测序成功,该序列进行NCBI在线BLAST比对,发现该序列与毒株(Gene ID:Z48163.2)的具有100%同源性,但在测序成功的序列中为未找到SFV开放阅读框。2.7.4甘蔗花叶病毒的全基因组序列拼接及分析在样本K26中,注释为ScMV的Congting0013588长度为4113bp,利用NCBI在线BLAST软件同源性分析显示,该ScMV可疑序列与分离自中国浙江株(Gene ID:18652414)具有99%的同源性,经查看中国浙江株该可疑序列比对的位置,可疑编码NIa-VPg、NIa-Pro等蛋白。我们从GenBank上下载其他ScMV序列,经ClustalW进行多序列比对分析后,构建进化树分析,显示可疑ScMV与中国河北株(Gene ID:AJ310109)邻近。2.8蝙蝠采集情况蝙蝠狂犬病毒的检测2011年8月在广东惠州共收集蝙蝠88只,包括3个科,5个种的蝙蝠。利用RT-LAMP方法检测阳性率为22.73%(20/88),其中中蹄蝠样本阳性率为32.26%(10/31),大足鼠耳蝠21份样本全部来自惠州龙门同一个山洞,其中8份样本检出LAMP方法阳性条带,阳性率38.1%(8/21);全部小黄蝠都是来自惠州市区某酒店旁的棕榈树,其中2份样本检出LAMP方法阳性条带,6.06%(2/33)。2011年8月至2013年11月之间,四次共收集5个科,共11种蝙蝠,545只蝙蝠,全部应用Nested RT-PCR方法进行检测,总阳性率为23.49%(128/545)。首次采样样本阳性率为30.68%(27/88),阳性样本全部来自中蹄蝠、大足鼠耳蝠;2011年10月114份样本中,其中104份普通长翼蝠样本检出阳性32份,阳性率30.77.24%(32/104);2013年8月96份样本中,普通长翼蝠样本中再次检出阳性11份,阳性率17.19%(11/64),棕果蝠样本中再次检出阳性8份,阳性率29.63%(8/27);广东云浮样本中,三种蝙蝠均有阳性样本检出,其中以普通伏翼检出率最高,阳性率为25.77%(42/163)。对2011年8月采集的88份蝙蝠脑组织样本,RT-LAMP阳性率为22.73%,而nested RT-PCR方法阳性率为30.68%,用两种检测方法检出率经统计学检验未发现差异(P=0.092)。两种方法在不同种类的蝙蝠阳性的检出情况基本一致。2.9狂犬病毒长片段的序列分析经细胞培养或者乳鼠接种,其中4份样本经长序列引物扩增并测序,4份样本的狂犬病毒核苷酸同源性在97%～109%,提示此次在蝙蝠中检测出的狂犬病毒序列差异不大。用GenBank的在线软件BLAST进行同源性分析,4份样本与2008年从中国广东犬脑中分离出的狂犬病毒核苷酸同源性>99%,属于genotype 1狂犬病毒。经狂犬病毒N基因的的核苷酸序列构建系统进化树分析,本研究4个样本全部属于genotype 1狂犬病毒,其中,HZ8和YF15株相互临近,HZ47株与来自法国学者上传的疫苗株非常接近,HZ1株与我国河南分离自犬脑的街毒株临近。3结论3.1建立了基于高通量测序的蝙蝠组织病毒宏基因学方法,应用于脑、血清、直肠都获得了成功,检测到大量动物病毒和植物病毒的核酸序列。3.2应用病毒宏基因组学方法分析,提示BHK-21细胞不适宜双链RNA病毒的培养,细胞培养对病毒的种类和丰度都有影响。3.3初步分析蝙蝠携带HIV,SFV序列,但是序列中不含开放阅读框;蝙蝠携带有HPV的L1蛋白核苷酸序列和RV的N蛋白核苷酸序列;蝙蝠携带有ScMV序列,经本研究宏基因组学和PCR核酸扩增分析,提示蝙蝠具有携带上述病毒可能性。3.4本研究蝙蝠样本携带狂犬病毒,应用Nested RT-PCR方法检测狂犬病毒的总携带率高达23.49%,比往年和国内其他研究者报告结果高。3.5本研究检测出的长为895bp的狂犬病毒序列差异不大,属于基因1型狂犬病毒,与亚洲流行的基因型别和本课题组以往研究一致。