目的肥胖已成为影响发展中国家和发达国家数百万人身体健康的公共卫生问题。全身慢性低度炎症与肥胖密切相关,是造成肥胖者胰岛素抵抗的重要病因。胰岛素抵抗是肥胖危害健康的关键启动因素,会引起葡萄糖不耐受、血脂紊乱和2型糖尿病、动脉粥样硬化和高血压等疾病的出现。从目前看来,肥胖人群或动物模型炎症和促炎细胞因子的来源方面都以脂肪组织为研究重点,但最新发现指出,肥胖饮食可能会导致肠道微生物群稳态失常,致使肠道炎症活化、胃肠动力的变化,这与胰岛素抵抗的发展密切相关。因此,尽早对肥胖和胰岛素抵抗采取相关的干预措施,对于预防或限制肥胖对健康的不良影响意义重大。本实验采用高脂饮食诱导的方式进行造模,对于造模成功的胰岛素抵抗肥胖Wistar大鼠,通过电针疗法进行干预,从小肠炎症反应为切入点,观察该法对胰岛素抵抗肥胖大鼠小肠组织中沉默信息调节因子(SIRT1),Toll样受体4(TLR4),核因子-κB(NF-κB)以及小肠黏膜炎症状态的影响,分析电针增强胰岛素敏感性与改善小肠炎症之间的相关性,探讨电针通过SIRT1/TLR4调控小肠组织炎症以改善胰岛素抵抗肥胖的机制,以期为临床运用针刺防治肥胖及其相关代谢性疾病提供实验依据。方法选择8周龄SPF级Wistar雄性大鼠,总数为90只,在适应性喂养一周的时间后,选用随机数字表法进行分组,涵盖采用普通饲料喂养的正常组(n=15)和采用高脂饲料喂养的造模组(n=75)。在正常饲养8周时间后,从正常组随机抽取5只,造模组随机抽取20只大鼠,然后实施高胰岛素-正葡萄糖钳夹术,从而评判胰岛素抵抗模型造模成功与否;此外,还需要测量每只大鼠的体重及肛鼻长以计算出Lee’s指数,以此来判断肥胖模型的成功与否,同时满足以上两种评判标准的模型,才可认定为造模成功。将给予高脂饲料喂养,并造模成功的大鼠随机分为5个组别:模型组、电针组、电针+抑制剂组(针+抑组)、抑制剂组、激动剂组,每组10只;同时,随机抽取普食喂养的大鼠10只,为正常组。分组结束后,正常组继续予以普通饲料饲养,不采取任何干预措施;其余五组均给予高脂饲料进行喂养,模型组不采取任何干预措施。电针组采用电针治疗,选择下肢双侧的足三里穴、丰隆穴,腹部的关元穴、中脘穴,针刺深度为3-5毫米,并使用韩式电针仪,将电针仪的频率设定为2Hz,电针仪强度设为1mA,采用连续波,干预时间每次持续10min,3次/周,整个疗程持续8周;电针+抑制剂组除予以与电针组相同的电针治疗方法外,以每只大鼠的体重为基础,根据1mg/kg的单位比例,采取尾静脉注射的方式,算出每只大鼠Sirtinol抑制剂的注射量,3次/周,干预持续8周;抑制剂组仅给予Sirtinol抑制剂尾静脉注射,持续8周;激动剂组根据每只大鼠的体重,依据200mg/kg的单位比例,算出每只大鼠白藜芦醇的灌胃量进行灌胃治疗,3次/周,干预持续8周。在干预进行期间,分别在干预的第0周、2周、4周、6周、8周对各组大鼠进行体重的测量和记录;此外,在完成第6周的干预治疗后,对所有大鼠进行腹腔糖耐量(IPGTT)以及腹腔胰岛素耐量(IPITT)的检测与记录;在八周的干预治疗完成后,自各组大鼠中随机选出3只,实施高胰岛素-正葡萄糖钳夹术,在此期间同时测量葡萄糖输注速率(GIR)。干预完成之后,进行心尖取血,处死各组大鼠并取材。将心尖取出的血液使用ELISA法检测血清内毒素(LPS)水平和血清炎症因子CRP、TNF-α、IL-6和血清胰岛素的含量,以及生化法检测TC、TG、FFA的水平变化情况。此外,应用苏木精-伊红染色法(HE)观察小肠黏膜的形态变化;采用蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测各组小肠组织中的SIRT1、TLR4、NF-κB的蛋白表达量;并选用实时荧光定量PCR法(RT-PCR)检测各个组别的小肠组织中SIRT1、TLR4、NF-κB的基因表达水平的改变。结果1.高脂饮食喂养八周后对大鼠体重、Lee’s指数及GIR的影响八周喂养结束后,高脂饲养的造模组较普食饲养的正常组在体重方面明显升高(P<0.01),高脂饲养的造模组较普食饲养的正常组在Lee’s指数方面增加(P<0.05),高脂饲养的造模组GIR指数明显低于正常组(P<0.01)。2.电针对胰岛素抵抗肥胖大鼠体重、脂质代谢、血清胰岛素、胰岛素敏感性以及GIR的影响在体重变化方面,八周电针治疗后,与模型组比较,电针组和激动剂组显著降低(P<0.01),抑制剂组明显上升(P<0.05);针+抑组与抑制剂组较电针组均明显升高(P<0.01);抑制剂组和激动剂组的较针+抑组均有显著性差异(P<0.01)。在脂质代谢方面,与模型组相比,电针组与激动剂组TC、TG、FFA含量均显著下降,针+抑组TC、TG、FFA含量显著降低(P<0.05),且抑制剂组TC、TG、FFA含量明显上升(P<0.01),说明电针可以改善IR肥胖大鼠的脂代谢紊乱状态;与电针组相比,针+抑组和抑制剂组TC、TG、FFA含量增值幅度明显(P<0.01);而抑制剂组和激动剂组TC、TG、FFA含量较针+抑组差异具有显著性意义(P<0.01)。在血清胰岛素(INS)方面,与模型组相比,电针组、针+抑组和激动剂组血清胰岛素(INS)水平明显下降(P<0.01),抑制剂组血清胰岛素(INS)水平均明显上升(P<0.01);且针+抑组和抑制剂组的血清胰岛素(INS)水平明显高于电针组(P<0.01);与针+抑组相比,抑制剂组的血清胰岛素(INS)水平明显升高(P<0.01),激动剂组的血清胰岛素(INS)水平减值幅度明显(P<0.01)。在IPGTT方面,电针组和激动剂组血糖水平较之模型组明显降低(P<0.01),针+抑组血糖水平较之模型组降低(P<0.05),抑制剂组的血糖水平较之模型组升高(P<0.01);针+抑组明显高于电针组(P<0.05),抑制剂组血糖水平亦高于电针组(P<0.01);针+抑组血糖水平明显低于抑制剂组(P<0.01)和高于激动剂组(P<0.01)。在IPITT方面,电针组和激动剂组的血糖水平明显优于模型组(P<0.01),抑制剂组的血糖水平较之模型组显著增高(P<0.01);电针组的血糖水平明显低于针+抑组和抑制剂组(P<0.01);而针+抑组血糖水平明显低于抑制剂组(P<0.01)和高于激动剂组(P<0.01)。在GIR方面,与治疗后同时期模型组相比,电针组和激动剂组GIR值均显著升高(P<0.01),针+抑组GIR值明显上升(P<0.05),抑制剂组GIR值降低(P<0.05);与治疗后同时期电针组相比,抑制剂组GIR值亦明显下降(P<0.01);与治疗后同时期针+抑组比较,抑制剂组GIR值显著减少(P<0.01),激动剂组GIR值升值幅度明显(P<0.01)。3.电针对胰岛素抵抗肥胖大鼠血清内毒素(LPS)、血清炎症因子CRP、TNF-α、IL-6及小肠黏膜组织形态的影响在血清LPS水平比较上:与模型组相比,电针组与激动剂组血清LPS含量均显著下降(P<0.01),针+抑组血清LPS水平亦降低(P<0.05),而抑制剂组血清LPS含量明显增高(P<0.01);与电针组相比,针+抑组血清LPS含量明显上升(P<0.05),抑制剂组血清LPS含量亦显著升高(P<0.01);而与针+抑组相比,抑制剂组血清LPS含量明显增高(P<0.01),激动剂组血清LPS含量显著降低(P<0.05)。在血清炎症因子水平比较上:与模型组相比,电针组和激动剂组血清CRP、TNF-α和IL-6含量均明显降低(P<0.01);针+抑组血清CRP、TNF-α和IL-6含量亦减少(P<0.05);抑制剂组血清CRP、TNF-α均明显上升(P<0.01),血清IL-6水平亦升高(P<0.05)。与电针组比较,针+抑组血清CRP、TNF-α和IL-6含量均显著增高(P<0.05),抑制剂组血清CRP、TNF-α和IL-6含量均显著升高(P<0.01)。与针+抑组相比,抑制剂组血清CRP、TNF-α和IL-6水平均显著升高(P<0.01);激动剂组血清CRP、TNF-α均明显下降(P<0.05),而血清IL-6水平亦显著减少(P<0.01)。在小肠黏膜形态变化和Chiu’s评分:正常组小肠黏各层膜结构完整,上皮细胞排列相对比较整齐,绒毛排列较规则且未出现断裂表现;与正常组相比,模型组、抑制剂组大鼠的小肠黏膜细胞有萎缩、糜烂、炎性浸润等现象;与模型组相比,电针组、激动剂组的小肠黏膜组织结构较清晰,萎缩、糜烂、炎性浸润现象减轻。与模型组相比,电针组、针+抑组和激动剂组Chiu’s评分明显下降(P<0.01),抑制剂组Chiu’s评分明显升高(P<0.01);与电针组比较,针+抑组和抑制剂组Chiu’s评分均显著上升(P<0.01);与针+抑组相比,抑制剂组Chiu’s评分明显增高(P<0.01),激动剂组Chiu’s评分明显下降(P<0.01)。4.电针对胰岛素抵抗肥胖大鼠小肠SIRT1、TLR4、NF-κB蛋白及mRNA表达的影响在蛋白表达方面:与模型组相比,电针组和激动剂组的SIRT1蛋白表达明显增高(P<0.01),TLR4和NF-κB蛋白表达明显降低(P<0.01);针+抑组SIRT1蛋白表达高于模型组(P<0.05),NF-κB蛋白表达显著低于模型组(P<0.05);抑制剂组SIRT1蛋白表达较模型组显著下降(P<0.01),TLR4和NF-κB蛋白表达明显升高(P<0.01)。与电针组比较,针+抑组和抑制剂组SIRT1蛋白表达均明显下降(P<0.01),TLR4和NF-κB蛋白表达均显著上升(P<0.01)。与针+抑组相比,抑制剂组SIRT1蛋白表达均显著降低(P<0.01),TLR4和NF-κB蛋白表达明显增高(P<0.01);激动剂组SIRT1蛋白表达均明显上升(P<0.01),TLR4和NF-κB蛋白表达明显降低(P<0.01)。在mRNA基因表达方面:与模型组相比,电针组和激动剂组的SIRT1mRNA表达明显升高(P<0.01),TLR4和NF-κB mRNA表达显著降低(P<0.01);针+抑组的SIRT1 mRNA表达明显上升(P<0.05),TLR4和NF-κB mRNA表达亦降低(P<0.05);抑制剂组SIRT1 mRNA表达较模型组显著下降(P<0.05),TLR4和NF-κB mRNA表达明显升高(P<0.01)。与电针组比较,针+抑组和抑制剂组SIRT1 mRNA表达均显著降低(P<0.01),针+抑组TLR4和NF-κB mRNA表达升高明显(P<0.05),且抑制剂组TLR4和NF-κB mRNA表达均显著上升(P<0.01)。与针+抑组相比,抑制剂组SIRT1 mRNA表达显著降低(P<0.01),TLR4和NF-κB mRNA表达明显增高(P<0.01);激动剂组SIRT1 mRNA表达均明显上升(P<0.01),TLR4和NF-κB mRNA表达明显降低(P<0.05)。结论1.电针和SIRT1激动剂均能够减轻IR肥胖大鼠的体重及其增长速度,减少机体内血脂TC、TG、FFA的含量,并且可以使IR肥胖大鼠的胰岛素敏感性增强,从而改善IR状态。说明电针可通过特异性的上调SIRT1来改善肥胖和IR状态。而应用了SIRT1抑制剂的针+抑组较电针组的体重增长速度明显上升,血脂TC、TG、FFA水平明显增高,胰岛素敏感性下降,说明SIRT1抑制剂可以部分逆转电针的效应。2.电针和SIRT1激动剂均能够降低IR肥胖大鼠血清炎症因子TNF-α,IL-6含量,降低IR大鼠血清中的血清中LPS的水平,减轻IR状态。同时电针还可减轻小肠黏膜组织的萎缩、糜烂以及炎性浸润状态。说明电针可通过特异性的上调SIRT1来改善机体炎症状态,减轻小肠炎症反应。而应用了SIRT1抑制剂的针+抑组较电针组会出现血清LPS水平和炎症因子水平增高,小肠黏膜组织的萎缩、糜烂以及炎性浸润状态加重的现象,说明说明SIRT1抑制剂可以部分阻断电针改善机体炎症状态的效应。3.电针和SIRT1激动剂均可上调IR肥胖大鼠小肠组织SIRT1蛋白及基因的表达水平,从而下调TLR4蛋白和基因的表达,使得NF-κB蛋白和基因的合成减少。而应用了SIRT1抑制剂的针+抑组较之电针组其SIRT1蛋白和基因表达明显下降,TLR4和NF-κB蛋白和基因表达水平上升,说明说明SIRT1抑制剂可以部分拮抗电针的效应。4.SIRT1抑制剂可以部分逆转电针的效应,表明电针是通过促进SIRT1的表达,从而下调toll样受体4(TLR4)的表达,改善肠道菌群紊乱状态,抑制NF-κB的表达,发挥抗炎效应,继而控制饮食,调节体重,并使外周胰岛素敏感性提高,达到改善IR,这是电针改善胰岛素抵抗的新机制。