纳豆是日本传统的大豆发酵食品,由纳豆芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)发酵而得,具有多种营养保健功能。但在纳豆发酵的过程中纳豆芽孢杆菌代谢生成氨,使纳豆有刺激性气味。研究表明引起纳豆芽孢杆菌发酵产氨的主要是氨基酸脱羧酶催化的转氨作用、谷氨酸脱氢酶(GDH)催化的联合脱氨基作用及脲酶催化的尿素降解作用。脲酶是纳豆芽孢杆菌氮代谢途径中很重要的一种胞内酶,可催化尿素水解生成二氧化碳和氨,而有关枯草芽孢杆菌中脲酶对代谢影响研究较少。本研究首先研究纳豆芽孢杆菌脲酶的酶学性质,探索是否可以通过控制发酵条件,生产低氨味纳豆。同时,得到酶活研究的最适产酶条件。本文研究了不同的碳源、氮源及不同的培养条件下纳豆芽孢杆菌(CGMCC No.2801)的脲酶产量及温度、pH和金属离子对脲酶活性的影响。结果表明以谷氨酸为氮源,蔗糖为碳源,pH 7,37℃条件下培养12 h时脲酶的产量最高,为57.2μg/mL。脲酶的最适反应条件为35℃、p H 7,所选的几种金属离子对脲酶活性均有抑制作用,抑制强度为Cu2+>Zn2+>Fe2+>Mg2+>Mn2+,最大抑制率为36.4%。纳豆芽孢杆菌发酵生产纳豆的条件与产脲酶最适条件基本一致,难以通过调节发酵条件调控脲酶的产量。本文按照同源重组双交换方案构建了纳豆芽孢杆菌脲酶缺失突变的重组载体,以期构建脲酶编码基因(ure)缺失的低产氨纳豆芽孢杆菌工程菌,从而在保证其发酵品质的同时降低氨产量。根据对纳豆芽孢杆菌ure基因及其上下游序列的分析,设计引物,pcr扩增得到ure上下游同源臂ure12和ure34,并在同源臂中引入hindiii、xhol、bamhi和sali/bamhi酶切位点,测序结果表明序列正确,没有发生移码突变。将ure上下游同源臂通过ta克隆分别连接到peasy-t1载体上,再通过酶切、酶连将ure上下游同源臂ure14连接到温敏型质粒pksv7,构建得到重组载体pksv7:ure14。通过pcr扩增、hindiii/bamhi双酶切和测序验证构建成功,测序结果与纳豆芽孢杆菌同源性为100%,没有出现突变和移码现象,可以将该载体用于构建ure缺失菌株。纳豆芽孢杆菌(cgmccno.2801)的ure基因及其上下游序列与枯草芽孢杆菌168的同源性为97%。本研究采用电转化和原生质体转化的方法将重组载体pksv7:ure14分别转化纳豆芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌168。以培养至od600为1.1的纳豆芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌168制备感受态,以0.5mol/l的甘露醇、0.38mol/l山梨醇配制电击缓冲液,电击参数为25μf、200Ω和2.2kv时,得到枯草芽孢杆菌168的阳性转化子。以终浓度为5mg/ml的溶菌酶制备得到较高质量原生质体感受态,以40%的peg6000介导转化,得到枯草芽孢杆菌168的阳性转化子,pcr及测序验证正确。