背景及目的:肺恶性肿瘤是目前全球范围内具有高发病率及高死亡率的恶性肿瘤,其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）约占85%,预后不佳。目前肺癌在手术、放疗、化疗及分子靶向治疗方面虽取得了很大的进步,然而治疗效果仍不理想,获得性耐药的出现严重阻碍了肺癌治疗的效果。DNA发生损伤后会影响细胞周期,检查点蛋白可引起细胞周期阻滞,为DNA修复提供修复时间,DNA损伤超过修复能力则触发细胞凋亡途径。CHK2是DNA损伤反应的关键调节因子,是其信号传导通路中的重要元件,也是各种细胞生存和各种病生过程的重要监督者,参与细胞凋亡、细胞周期阻滞和DNA损伤修复等重要生命活动。乳酸化修饰作为一种重要且全新的蛋白质翻译后修饰,而非组蛋白是否发生乳酸化修饰尚未报道。本课题主要以研究非组蛋白CHK2乳酸化修饰是否参与细胞耐药调控作为研究对象,研究全新的蛋白质翻译后修饰---乳酸化修饰改变所发挥的作用。方法:1、通过流式细胞术研究乳酸钠处理是否影响顺铂诱导细胞凋亡,铺板贴壁加药,加入乳酸钠NALA（20mmol/L）和Cisplatin（30μmol/L）药物后处理24小时收样,分为阴性对照组、PI组、FITC组、以及FITV-PI双染组,选用凋亡试剂盒处理后在常温充分反应15min后（注意避光）加入1xbinding buffer 1小时内上机检测细胞凋亡。2、利用免疫荧光技术研究乳酸钠NALA及乳酸脱氢酶抑制剂OX是否影响细胞周期,6孔板置入细胞爬片,铺板待细胞贴壁后加药物处理,乳酸5mmol/L,乳酸脱氢酶抑制剂10mmol/L,加入乳酸及乳酸脱氢酶抑制剂12h后加入Cisplatin30μmol/L,12h后吸净培养基,pbs冲洗后撤药,2h后收细胞固定清洗敷抗体过夜,次日处理后镜下观察p-H3阳性细胞比例。3、利用克隆集落实验验证乳酸钠及乳酸脱氢酶抑制剂是否对顺铂有杀伤肺癌细胞的作用。实验中分别加入浓度0、0.5、1、1.5μmol/L Cisplatin处理,乳酸钠10mmol/L,乳酸脱氢酶抑制剂10mmol/L,处理7-9天后观察克隆集落细胞数,待每个克隆细胞数＞50个可收板,固定染色后拍照并image-J计数分析。4、利用Co-IP和western blot实验检测CHK2是否存在乳酸化修饰。293T细胞转染CHK2,乳酸钠20mmol/L,乳酸脱氢酶抑制剂10mmol/L,处理24小时收样进行免疫共沉淀Co-IP实验并进行wb实验,确定CHK2的是否存在乳酸化修饰。同时Sh LDHA2/B1、sh LDHA2/B3稳株构建成功后进行CHK2转染利用特异性sh RNA构建LDHA、LDHB敲低的稳定细胞株稳株明确乳酸对CHK2乳酸化的影响。48小时后收样进行免疫共沉淀实验Co-IP实验,蛋白收样后上样进行wb实验5、利用western blot实验探讨乳酸钠及乳酸脱氢酶抑制剂调控CHK2介导的信号通路。6孔板细胞贴壁后加入NALA 20mmol/L,OX 10mmol/L,DNA损伤诱导剂Cisplatin30μmol/L,处理24小时收样进行wb实验,检测信号通路关键分子CHK2、p53,同时检测其磷酸化p-CHK2、p-p53以及cleave parp蛋白表达水平6、利用Co-IP和western blot实验筛选鉴定CHK2的乳酸化修饰酶和去乳酸化修饰酶,细胞铺板贴壁后加入HDAC抑制剂TSA（1:1000）和SIRT家族抑制剂NAM（1:100）处理24小时收样进行免疫共沉淀实验Co-IP实验后再进行wb实验,根据结果分析确定CHK2乳酸化修饰中去乳酸化修饰酶eraser类型。其次再转染SIRT家族质粒和CHK2质粒至293T细胞中,48小时后收细胞进行免疫共沉淀实验Co-IP实验随后进行wb实验。同时转染乙酰转移酶库质粒和CHK2质粒至293T细胞中,48小时后收细胞进行免疫共沉淀实验Co-IP实验随后进行wb实验。293T细胞铺板贴壁24小时后加入药物CBPi（1:1000浓度）处理24小时收细胞做Co-IP和western blot实验;构建sh CBP稳株后转染CHK2后48小时后回收细胞做Co-IP和western blot实验。7、筛选鉴定CHK2乳酸化修饰位点。进行质粒构建和点突变设计合成引物后,以DNA目的质粒为模板进行PCR扩增、转化、酶联、DNA胶回收、转染、免疫共沉淀实验及western blot等实验技术寻找乳酸化修饰点。8、利用western blot探究乳酸化修饰位点突变后对CHK2下游信号通路。构建携带CHK2野生型及K492/494R突变稳定肺癌细胞株,细胞铺板贴壁固定后加入NALA（20mmol/L）、Cisplatin30μmol/L,加药后24小时回收蛋白后进行WB实验,检测P53、P-53、cleave parp下游分子。9、利用免疫荧光技术探究乳酸化修饰对调控细胞周期影响,利用构建的携带CHK2野生型及K492/494R突变稳定肺癌细胞株,铺板细胞贴壁后加入乳酸,浓度5mmol/L,乳酸脱氢酶抑制剂组,浓度10mmol/L,加入乳酸或乳酸脱氢酶抑制剂12h后加入DNA损伤诱导剂Cisplatin30μmol/L,12h后吸净培养基,pbs冲洗后撤药,加入普通培养基2h后收细胞,固定透化敷抗体过夜处理后染色。10、利用CCK-8实验探究CHK2乳酸化修饰对化疗效果影响。细胞铺板贴壁后,Cisplatin浓度按照0、20、40、60、80μmol/L加入野生型细胞和携带CHK2KR突变两种稳株细胞并联合加入NALA20mmol/L,OX10mmol/L,加药处理2-3天后利用CCK8试剂盒处理4小时上机检测结果,同时可以搜集TGCA数据库分析CHK2对肺癌生存率影响。结果:1、流式细胞凋亡检测发现加入顺铂+乳酸钠组比单加顺铂组细胞凋亡率下降,表明乳酸钠处理抑制顺铂诱导细胞凋亡。2、通过抗磷酸化组蛋白3-H3Ser10抗体（P-H3）免疫染色方法发现乳酸钠处理引起细胞周期G2/M检验点功能下降,阳性细胞增多,乳酸脱氢酶抑制剂处理导致G2/M检验点功能增强,引起细胞周期阻滞,进入有丝分裂期细胞减少,说明乳酸钠及乳酸脱氢酶抑制剂影响细胞周期G2/M阻滞。3、乳酸钠可显著增强肺癌细胞对化疗药物顺铂的耐受,乳酸脱氢酶可显著提高化疗药物顺铂对肺癌细胞的杀伤效果,表明乳酸钠及乳酸脱氢酶抑制剂对顺铂杀伤肺癌细胞的影响。4、CHK2作为一种非组蛋白,可发生乳酸化修饰,同时特异性sh RNA构建LDHA、LDHB敲低的稳定细胞株,并将CHK2转入这些稳定细胞株检测CHK2的乳酸化水平,发现联合LDHA、LDHB显著下调CHK2的乳酸化水平再次表明CHK2可发生乳酸化修饰5、乳酸钠抑制cisplatin诱导的CHK2介导的p-p53水平,并可抑制cleave parp蛋白水平,表明乳酸钠抑制CHK2活性,并抑制细胞凋亡;乳酸脱氢酶抑制剂促进cisplatin诱导的CHK2介导的p-p53水平,并可促进cleave parp蛋白水平,表明乳酸脱氢酶抑制剂促进CHK2活性,并促进细胞凋亡。结果表明乳酸钠及乳酸脱氢酶抑制剂调控CHK2介导的信号通路。6、通过去乙酰化酶抑制剂NAM（SIRT家族抑制剂）、TSA（HDAC抑制剂）以及筛选乙酰转移酶库和去乙酰化酶库发现CBP具有乳酰转移酶的活性,而SIRT1、2具有去乳酰转移酶的活性,分别促进CHK2发生乳酸化修饰和去乳酸化修饰。加入SIRT家族抑制剂NAM后CHK2乳酸化修饰水平升高,说明SIRT家族参与调控CHK2乳酸化修饰水平;加入CBP抑制剂CBPi发现CHK2的乳酸化修饰酶水平下降;构建sh CBP稳株,转染CHK2后48小时收细胞做Co-IP和western blot实验,sh CBP稳株细胞CHK2的乳酸化修饰酶水平下降,再次验证CBP为CHK2的乳酸化修饰酶。上述结果表明CHK2的去乳酰化修饰酶eraser是sirt1/2,CHK2乳酰化修饰的writer是CBP。7、质粒构建和点突变设计筛选CHK2发生乳酸化修饰的位点,筛查鉴定K492/494R为CHK2发生乳酸化修饰主要位点8、野生型CHK2在化疗药物cisplatin诱导后加入乳酸钠可导致p-p53、cleave parp蛋白水平下降,表明乳酸钠可通过影响乳酸化修饰水平影响CHK2信号通路,且乳酸化修饰水平增强可通过抑制CHK2功能从而抑制细胞凋亡,在K492/494R突变细胞中我们发现乳酸钠因无法调节CHK2乳酸化修饰位点乳酸化水平,在化疗药物诱导后中对p-p53、cleave parp蛋白水平几乎无影响,并未引起p-p53、cleave parp蛋白水平下降。9、携带CHK2 K492/494R突变细胞增加顺铂诱导的细胞周期G2/M阻滞,有丝分裂细胞减少;乳酸钠抑制CHK2野生型顺铂诱导的细胞周期G2/M阻滞,但不能抑制携带CHK2 K492/494R突变细胞顺铂诱导的周期G2/M阻滞;乳酸脱氢酶抑制剂可增强CHK2野生型顺铂诱导的细胞周期G2/M阻滞,但不能进一步增强携带CHK2 K492/494R突变细胞细胞周期G2/M阻滞,表明CHK2乳酸化修饰调控细胞周期G2/M检查点。10、相对于野生型细胞,携带CHK2 KR突变细胞对化疗药物顺铂更加敏感,乳酸钠可显著提高CHK2野生型肺癌细胞对化疗药物的耐受,但对携带CHK2 KR突变细胞确无明显影响;乳酸脱氢酶抑制剂提高化疗药物顺铂对CHK2野生型肺癌细胞杀伤效果,对携带CHK2 KR突变细胞无明显作用。上述结果表明CHK2乳酸化修饰对肿瘤细胞化疗效果存在一定影响。TGCA数据库分析发现高表达CHK2可显著提高患者的生存率。结论:CHK2乳酸化后可抑制CHK2激活,抑制细胞凋亡和细胞周期阻滞,促进肺癌细胞对化疗药物的耐受。