蚧虫在分类上属昆虫纲Insecta,半翅目Hemiptera,蚧总科Coccoidea。全世界已记录49科7500余种。在进化上它们与蚜虫的关系最为近缘,是重要的经济昆虫,大多数是农林、果树、花卉的重大害虫。蚧虫的最大特点是体壁具有多种蜡腺,能够分泌蜡质,在虫体表面形成固定形状的蜡层或蜡壳,对虫体起保护作用,化学杀虫剂不易渗入,防治十分困难。为探索利用病原真菌感染蚧虫,使其致病死亡,以减少虫口密度和危害,实现生物防治的新途径。本文选择专门危害松林的松干蚧科Matsucoccidae,松干蚧属Matsucoccus的日本松干蚧Matsucoccus matsumurae (Kuwana)作为古蚧类Archaeococcoids的代表,选择分布范围广、寄主多、虫体表面具有厚蜡壳保护的蚧科Coccidae蜡蚧属Ceroplastes的日本龟蜡蚧Ceroplastes japonicus Green作为新蚧类Neococcoids的代表。选择从蚧虫和褐飞虱上分离的病原真菌蜡蚧霉Lecanicillium lecanii V3.4504菌株和V3A505菌株、镰孢霉Fusarium incarnatum-equiseti HEBOl菌株和HEB02菌株作为试验菌种,研究病原真菌对这两种蚧虫的感染过程,引起的病理学症状和生化反应。日本松干蚧部分研究结果如下：1、日本松干蚧形态特征、泌蜡特点与发育进度的研究日本松干蚧雌雄两性变态复杂,不同龄期的形态结构变化很大,泌蜡特性不同,同时,日本松干蚧在我国东部地区从东北到南方都有分布,气候差异很大,虫体发育出现时间各地都有不同,以往的研究资料不太充分,对于应用病原真菌开展生物防治不能提供科学指导。本研究选择辽宁省抚顺市(](?)NFS)、山东省青岛市(SDQD)和浙江省金华市(ZJJH)作为三个气候区的代表,在日本松干蚧危害的林区布点,通过野外观测和室内显微观察拍照等方法,详细观察研究日本松干蚧的各龄期的发育、形态特征变化、泌蜡特点、出蛰、越冬、交配、产卵等生物学特性。结果表明,日本松干蚧在上述三个气候区都是一年发生两代,但三个气候区各虫态发育历期明显不同。ZJJH种群春季3月上旬开始出蛰、SDQD种群4月下旬-5月上旬出蛰,Ⅰ(?)NFS种群5月中旬-下旬才出蛰,LNFS种群在10月份进入越冬期,而ZJJH种群在12月才开始越冬。并发现这些差异与各地的温度变化直接相关。研究发现了日本松干蚧一些新的生物学特性和规律,特别是掌握了二龄珠形期若虫在春季的显露过程、三龄雄若虫分泌蜡丝和结茧行为、雄成虫的羽化、求偶与交配行为、雌成虫的羽化、交配、分泌蜡丝、形成卵囊和产卵行为。这些结果都为开展日本松干蚧的病理学研究和生物防治应用提供了基础。2、日本松干蚧雌性生殖系统的显微和超微结构研究日本松干蚧成虫期是一个交配和繁殖的时期,雌成虫的体腔内主要由卵巢占据,病原菌在这个阶段对日本松干蚧的侵染必然涉及到卵巢的病理变化,但是以往对雌成虫的生殖系统的结构还没有研究报道。本文采用光学显微镜、扫描电镜和透射电镜技术研究雌成虫生殖系统的构造,为组织病理学研究提供基础知识。结果表明,日本松干蚧的雌性生殖系统由一对卵巢、一个主输卵管、一对侧输卵管、一个储精囊和两对副腺构成。每一个卵巢具有大约50个端滋式卵巢管,卵巢管无端丝,占据体腔大部分空间。每个卵巢管包括一个端部的滋养室,一个生长区和一个末端的卵柄,卵柄与侧输卵管相连。滋养室包含8-10个滋养细胞和2个早期的卵黄发生前卵母细胞。卵成熟后,滋养细胞退化,停滞卵母细胞能够继续发育。生长区包含3-6个处于不同发育阶段的卵母细胞：卵黄发生前、卵黄发生和绒毛膜发生三个阶段。生长区的表面有多边形网状结构花纹,花纹中央具有一个圆形突起。卵母细胞内有大量的卵黄球和脂滴,外部被一单层滤泡细胞包围。首次在蚧虫中观察到滤泡细胞在卵黄发生的开始具有双核细胞；在卵黄发生过程中,卵母细胞质的外围具有副核。本研究结果首次提供了日本松干蚧雌成虫生殖系统的细微结构,为日本松干蚧的分类提供了新性状,为理解整个松干蚧科昆虫的进化地位提供了新的资料,具有重要意义,并为研究病原菌对日本松干蚧卵巢的感染和病理学症状分析提供基础。3、昆虫病原真菌蜡蚧霉和镰孢霉对日本松干蚧的致病性研究本文试验了昆虫病原真菌蜡蚧霉Lecanicillium lecanii V3.4504菌株和V3.4505菌株,镰孢霉Fusarium incarnatum-equiseti HEB01菌株和HEB02菌株对日本松干蚧四个龄期的致病性。结果表明,四个菌株都能引起日本松干蚧染病和死亡。蜡蚧霉的两个菌株比镰孢霉的两个菌株对日本松干蚧表现出更强的毒力,其中以蜡蚧霉V3.4505菌株的毒力最强,它的感染引起二龄若虫和雌成虫的死亡率分别为61.33%和100%。不同龄期的日本松干蚧对蜡蚧霉V3.4505菌株的敏感性不同,最敏感的阶段出现在雌成虫期和雄性三龄若虫期,但是雌成虫(LD50=1.96)比雄性三龄若虫(LD50=5.67)更容易感病。根据对日本松干蚧在不同发育阶段虫体的形态特征、体表结构、表皮层厚度和蜡壳的研究结果,分析了对病菌侵染敏感性不同的原因。确定了雌成虫和雄性三龄若虫为应用真菌进行生物防治的最佳虫期。这是首次关于病原菌感染日本松干蚧的报道。4.日本松干蚧受蜡蚧霉感染的组织病理学和糖代谢变化研究以日本松干蚧雌成虫作为研究对象,利用光学显微镜、扫描电镜和透射电镜技术,研究了病原真菌蜡蚧霉对日本松干蚧的感染过程和组织病理学。结果表明,蜡蚧霉能够快速的侵染日本松干蚧,主要通过体壁侵染。分生孢子在虫体表面附着后萌发很快,染菌12h后,在虫体表面就观察到菌丝。虫体的节间褶、背疤、足的基部和阴门处是病菌最易附着和分布的地方。染菌24h后,观察到菌丝已经穿透体壁,菌丝的入侵导致表皮层的蛋白质和几丁质嵌合结构变形。菌丝进入血腔后,首先侵染血细胞,导致血细胞的细胞膜破裂,细胞器消失,然后侵染其他内部组织。菌丝对肌肉的附着和入侵,导致菌丝周围的肌肉组织发生扭曲变形,肌纤维变得疏松：大量菌丝侵入脂肪体,导致脂肪细胞膜消失,多个脂肪细胞的脂滴融合在一起。卵巢管占日本松干蚧体腔的大部分,观察到菌丝附着和侵染卵巢管表面的滤泡细胞,使滤泡细胞和卵母细胞分离。菌丝在虫体内大量繁殖,耗尽虫体内的营养,菌丝又向虫体外扩散。本研究还发现病原菌可以直接通过阴门侵入虫体内部,对卵巢和相邻器官造成感染。利用生化反应和酶标仪测定了日本松干蚧感染蜡蚧霉后,血淋巴中糖代谢指标的变化。结果显示,染菌后,虫体内海藻糖酶的活性呈现先升高后降低的趋势,在染菌后12 h,染菌组虫体内的海藻糖降解酶活性就比对照组的高,36h后,其酶活性升高到最大值(0.480+0.020)U/mmg,约为对照组的1.5倍。随后海藻糖酶的活性很快下降。同时,染菌后,蚧虫血淋巴内海藻糖的含量逐渐降低,24 h后,处理组的海藻糖含量已低于对照组,到96h,其含量只有(0.623±0.047)mM。葡萄糖含量在12h到36 h期间快速上升,36 h后达到最高值(0.704±0.029)mM。随后其含量逐渐降低。这三项指标的变化说明,由于病原真菌的感染,引起虫体内海藻糖酶活性的增加,促进了海藻糖降解,转化成葡萄糖,形成了海藻糖酶—海藻糖—葡萄糖的连环反应,最终虫体内的营养被耗尽,虫体死亡。本研究结果从组织病理学和血糖平衡两方面揭示了蜡蚧霉如何感染和致死日本松干蚧。日本龟蜡蚧部分研究结果如下：5.病原真菌对日本龟蜡蚧蜡壳的入侵机制研究为了研究病原菌对蚧虫蜡壳的作用机理,选择蜡蚧霉Lecanicillium lecanii V3.4504菌株和V3.4505菌株,镰孢霉Fus arium incarnatum-equiseti HEB01菌株和HEB02菌株,以泌蜡量大的日本龟蜡蚧雌成虫作为对象进行研究。结果显示,蜡蚧霉能够成功的穿透日本龟蜡蚧的蜡壳侵入虫体,但是,病原菌在带有蜡壳的蚧虫上的生长、繁殖和入侵速度明显的比在没有蜡壳的虫体上慢,说明蜡壳对病原菌的入侵有阻碍作用；以蚧虫的完整蜡壳、单独蜡质、蜜露分别作为唯一碳源,制备成三种培养基,试验发现4个菌株在这三种培养基上都能萌发生长,形成菌落,说明真菌可以降解蚧虫蜡壳,并利用蚧虫蜡壳成分作为营养物质。4个菌株对完整蜡壳的降解率17.23%-18.70%显著大于对单独蜡质的降解率7.15%-12.78%,说明病原真菌在对蜡壳的降解过程中除了利用蜡质成分,还利用蜜露作为碳源营养。GC/MS分析显示,病原菌主要降解日本龟蜡蚧蜡壳中的酯醇和短链的羧酸酯。生化技术测定菌株代谢的酯酶活性的变化,结果显示酯酶参与了蜡壳的降解,酯酶活性与病原菌对蚧虫的致死率之间呈显著正相关,回归方程：y=0.0127x-0.6605,R2=0.9431。本研究结果揭示了病原真菌降解蚧虫蜡壳的机制。6.病原真菌对日本龟蜡蚧体壁的穿透及胞外酶的作用本文研究病原真菌对日本龟蜡蚧体壁的穿透过程及胞外酶的作用,采用了麦胚凝集素/卵类黏蛋白-胶体金细胞化学标记技术,将胶体金颗粒成功地结合到日本龟蜡蚧原表皮的几丁质上,利用透射电镜首次观察到几丁质的片层结构,发现几丁质纤维丝呈螺旋状排列,并观察到病原菌穿刺进入体壁,导致表皮几丁质片层结构断裂的组织病理学症状,在菌丝周围标记几丁质的颗粒减少,说明几丁质已被病原菌分泌的胞外酶降解。用酶标仪测定病原菌分泌的类枯草杆菌蛋白酶(Prl)、几丁质内切酶、几丁质外切酶(p-乙酰-N-葡萄糖苷酶,NAG)和脂肪酶活性,结果显示这四种酶都参与了蚧虫表皮的降解,其中脂肪酶的活力最高值出现的最早,在培养2d后即达到最大值,蛋白酶活性次之,培养3d后达到最大值,而几丁质内切酶和几丁质外切酶的活性在培养4-5 d天后才达到最大值。说明这几种酶在降解体壁成分中作用的先后顺序,病原菌在入侵体壁过程中首先接触到上表皮,分泌脂肪酶降解上表皮中的脂肪,然后侵染原表皮,诱导蛋白酶降解蛋白质,几丁质骨架暴露出来,几丁质酶再发挥作用,降解几丁质。在这些酶的联合作用下将表皮降解,以利菌丝穿透体壁。而菌丝周围标记几丁质的颗粒减少,印证了几丁质内切酶和几丁质外切酶的降解作用。日本龟蜡蚧的致死率与NAG酶活性之间呈显著正相关(R2=0.9109)。7.病原真菌对日本龟蜡蚧血淋巴的感染作用研究采用透射电镜技术观察了蜡蚧霉进入日本龟蜡蚧血腔后对血细胞的感染作用,在蜡蚧霉侵染初期的样本上,观察到蚧虫血淋巴中的浆细胞和粒细胞将病原菌吞噬并消化的现象；在侵染后期的样本上,观察到大量病原菌侵入血细胞,使细胞膜破裂,细胞器消失；在受损的血细胞中还发现很多髓样小体。用酶标仪测定血淋巴中酚氧化酶、超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶的活性,结果显示,这四种酶在蚧虫感染后的2-3 d活性值都最高,在后期,血淋巴内的酶活力逐渐下降。同时测定了海藻糖酶活性、海藻糖和葡萄糖含量的变化,它们也呈现前期高后期低的变化规律,揭示出海藻糖和葡萄糖含量的变化与海藻糖酶活性呈显著的相关性,说明蜡蚧霉的入侵,对蚧虫免疫系统和糖代谢造成影响,是其致病的重要原因。该研究首次为蜡蚧霉感染蚧虫血淋巴的作用提供了新证据。