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本试验在前期小麦抗营养因子降解酶黑曲霉C2-56成功筛选的基础上,运用层析和双水相萃取的方法研究了不同纯化方法对黑曲霉C2-56产木聚糖酶的纯化效果,并对纯化酶的性质进行了的研究,试验结果表明:
1、黑曲霉C2-56木聚糖酶组成上,通过凝胶过滤层析和离子交换层析两步分离得该酶由两种成分组成,命名为Xyn Ⅰ和XynⅡ,二者分子量分别为26.20kD和121.41kD,其中酶活力较高的是分子量较小的Xyn Ⅰ组分。
2、通过筛选得到黑曲霉C2-56木聚糖酶分离纯化较好的条件。70%饱和度的硫酸铵可使木聚糖酶活力和蛋白质含量都较高,确定粗酶硫酸铵分级沉淀的最佳浓度为70%。Test-tube试验法发现,当缓冲液pH值为6.0时,上清液中木聚糖酶的相对酶活明显低于6.0后的,故选择pH值6.0的柠檬酸缓冲液作为木聚糖酶上离子交换柱时的缓冲体系。
3、黑曲霉C2-56木聚糖酶纯化策略为:通过硫酸铵盐析、透析脱盐、Sephadex G-100凝胶过滤,DEAE Sepharose Fast Flow离子交换等方法,分离提纯到黑曲霉C2-56木聚糖酶中的Xyn Ⅰ和Xyn Ⅱ组分。两个组分分别达到电泳均一程度,Xyn Ⅰ组分的纯化倍数和回收率分别为10.53和4.09%,Xyn Ⅱ组分的纯化倍数和回收率分别为2.33和0.74%。针对层析法两组分回收率较低的问题,用双水相萃取技术尝试分离纯化效果,得对Xyn Ⅰ组分而言,当选择PEG6000系列时,当选择PEG浓度为5%,磷酸盐浓度为10%,NaCl浓度为20%,木聚糖酶起始浓度为20mg/mL时,酶回收率最高,达到94.09%,纯化倍数为2.81倍,回收率和纯化倍数都较高。对XynⅡ组分而言,当选择PEG6000浓度为25%,磷酸盐浓度为9%,NaCl浓度为5%,木聚糖酶起始浓度为20mg/mL时,酶回收率最高,达到79.09%,纯化倍数为1.12倍,具有较好的纯化效果。对层析法而言,木聚糖酶各组分的纯化倍数相对较高,但是经历了多步纯化过程后,酶的回收率很低;PEG/磷酸盐双水相萃取具有成本低、操作简单、收率高、纯化效果好等优点。针对不同的生产要求,我们可以选用不同的纯化条件和方法及其组合。
4、纯化酶的性质:Xyn Ⅰ组分最适反应pH值为6.0,最适反应温度为60℃,在pH9.5时酶活比pH6.0时下降了61.01%,在70℃处理60min,剩余酶活仅有原来的39%,说明Xyn Ⅰ组分耐热性和酸碱稳定性较差。XynⅡ组分最适反应pH值也为6.0,最适反应温度为55℃,在pH9.5时酶活比pH6.0只下降了28.99%,在70℃处理60min,剩余酶活仍有最高酶活的65%以上,说明该组分有较强的耐热性和耐碱性。Mg<2+>、Cu<2+>、K<+>、Na<+>、Ag<+>、Zn<2+>、Ca<2+>对Xyn Ⅰ有极显著的促进作用,Hg<2+>和Fe<2+>对其有极显著的抑制作用。Na<+>对Xyn Ⅱ有显著的促进作用,Mn<2+>、Ag<+>对其有极显著的抑制作用。