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目的:1.探讨动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)斑块中单核-巨噬细胞(Monocyte/Macrophage)内微小核糖核酸199a(miR-199a-3p)表达含量变化及其可能的转运分泌的方式。2.探讨AS斑块内巨噬细胞高表达的miR-199a-3p可能的分泌、转运、摄取方式及其对外周血中单核-巨噬细胞转化过程中产生的作用。3.探究在AS中miR-199a-3p与巨噬细胞炎症反应间产生的相互影响作用及其可能的分子生物学机制方法:1.通过原位杂交荧光染色、原位杂交免疫染色及组织化学免疫染色法对AS斑块内巨噬细胞及miR-199a-3p表达含量及分布进行分析;通过流式分选技术分离人外周血中单核细胞,并通过超速离心法提取外周血血浆中外泌体(exosome),实时荧光定量PCR(Realtime PCR)法分别检测miR-199a-3p表达含量;体外培养人THP-1来源单核细胞,分别与AS及对照组exosome共培养后,通过原位杂交荧光染色及组织化学免疫染色法检测miR-199a-3p表达含量。2.将AS斑块组织及正常对照组织制成冰冻切片,通过免疫组织化学及免疫荧光化学法分析AS斑块内巨噬细胞表面CD163、HLA-DR及CD68蛋白分子表达含量及分布区域,同时分析AS斑块内巨噬细胞及其分泌exosome的表面Hb、Hp、CD163表达及分布差异,确定exosome可能的转运及摄取机制;体外培养THP-1来源单核细胞,分别与AS患者及正常对照组外周血中提取exosome共培养7天,通过免疫荧光双标和Western Blot检测细胞CD163、Hp及Hb表达含量;向体外培养的THP-1来源单核细胞转染miR-199a-3p模拟物(mimics),通过Western Blot及Realtime PCR法检测细胞CD68、CD163表达含量。3.体外培养人THP-1来源单核细胞,将miR-199a-3p模拟物转染至细胞体内,通过Realtime PCR检测细胞内趋化因子受体极迟抗原4(VLA-4)、淋巴细胞功能相关抗原(LFA-1)、肿瘤坏死因子a(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)的表达含量。结果:1.AS斑块中巨噬细胞miR-199a-3p的表达量较正常对照组明显上调,并可能以外泌体为载体分泌至外周血影响单核-巨噬细胞。2.AS斑块内AS斑块中CD163+、HLA-DR+细胞均有所表达;AS病变血管组织CD163+区域与Hp、Hb阳性区域高度重叠,提示在AS斑块内巨噬细胞表面表达的CD163分子可识别的Hp、Hb分子,并且这种识别作用可能以复合物的形式保持稳定;AS外周血中exosome促进单核细胞向巨噬细胞转化;miR-199a-3p可促进单核细胞向CD163+巨噬细胞转化。3.miR-199a-3p mimics可抑制巨噬细胞趋化因子受体及炎症因子的产生及释放。结论:1.动脉粥样硬化斑块中,巨噬细胞以exosome的形式分泌高表达的miR-199a-3p入外周血,并以外周血中的单核细胞为靶细胞发挥生物学效应,进而对动脉粥样硬化的发展产生进一步的影响2.AS斑块内巨噬细胞高表达miR-199a-3p可以exosome为载体,通过CD163-Hp-Hb的分子信号通路被外周血中单核细胞特异性识别;miR-199a-3p可以上调外周血中单核细胞表面清道夫受体CD163、CD68的表达,从而促进单核细胞向巨噬细胞转化并激活其吞噬功能。3.miR-199a-3p过表达可下调AS斑块内巨噬细胞趋化因子受体的表达、炎症因子的合成及释放,进而抑制AS斑块内炎症反应。