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目的:通过代谢组、蛋白组和转录组学方法初步研究补肾活血方(Tonifying Kidney and Activating Blood Formulas,TKABF)防治绝经后骨质疏松(Postmenopausal osteoporosis,PMOP)症的可能分子机制。方法:1.全骨髓贴壁法获取正常rBMSCs(Normal Bone Mesenchymal stem cells,NBM)和OP状态下rBMSCs(Osteoporotic bone Mesenchymal stem cells,OBM)并鉴定;采用双侧去卵巢法复制OP大鼠模型,双能X线法检测TKABF对去卵巢OP大鼠BMD的影响;ALP法检测cs TKABF促rBMSCs分泌ALP活性;2.3月龄SD雌性大鼠随机分为空白(Control)(n=6)与TKABF(n=6)组,TKABF组予以复方灌胃1.5m L,即1.035g/kg·d(人-大鼠体表面积换算大鼠等效量),相当于成人临床给药量(11.5g/d),Control组予以等体积(1.5m L)蒸馏水,灌胃12d,取血浆采用LC-MS对血浆代谢物进行分析;3.3月龄SD雌性大鼠随机分为空白(Control)(n=5)与TKABF(n=5)组,TKABF组予以复方灌胃1.5m L,即1.035g/kg·d(人-大鼠体表面积换算大鼠等效量),相当于成人临床给药量(11.5g/d),Control组予以等体积(1.5m L)蒸馏水,灌胃12d,取血清制备cs TKABF。i TRAQ法对NBM及cs TKABF+NBM(cs TKABF浓度为15%,干预24h)进行蛋白质高通量检测;4.3月龄SD雌性大鼠随机分为Sham(n=10)与OVX组(n=15),OVX组行去双侧卵巢术,Sham组行假手术。去卵巢12w评价模型复制成功,将OVX组随机分为OVX(n=9)与OVX+TKABF(n=6)组,OVX+TKABF予以复方灌胃3m L(去卵巢OP大鼠模型复制成功,给药时大鼠平均体重约为400g,因此,经换算给药量为3m L),即1.035g/kg·d(人-大鼠体表面积换算大鼠等效量),相当于成人临床给药量(11.5g/d),Sham与OVX组均予以等体积(3m L)蒸馏水。干预12w,取血清,采用i TRAQ法对血清蛋白进行高通量检测;5.3月龄SD雌性大鼠随机分为空白(Control)(n=5)与TKABF(n=5)组,TKABF组予以复方灌胃1.5m L,即1.035g/kg·d(人-大鼠体表面积换算大鼠等效量),相当于成人临床给药量(11.5g/d),Control组予以等体积(1.5m L)蒸馏水,灌胃12d,取血清制备cs TKABF。采用illumina Hiseq4000测序仪对NBM、OBM及cs TKABF+OBM(cs TKABF浓度为15%,干预24h)3组mRNA进行高通量测序。结果:1.P3代NBM与OBM组细胞CD29(99.93%与95.79%)、CD90(99.70%与99.55%)均呈阳性表达,而CD45(1.70%与1.46%)、CD80(4.45%与0.69%)均呈阴性表达;G0/G1所占比例分别为:87%与85.4%;生长曲线均呈S型;Gomori钙钴法ALP、茜素红、油红O以及甲苯胺蓝染色均呈阳性;与Sham组比较,OVX组大鼠右股骨、右肱骨、左股骨近端和远端以及L4-5等部位BMD显著降低(P≤0.01),TKABF干预12w,与OVX组比较,OVX+TKABF组右股骨、右肱骨、左股骨近端及远端BMD显著高于OVX组(P≤0.01);与Control组比较,cs TKABF+NBM与cs TKABF+OBM分泌ALP活性均显著增高(P≤0.01);2.TKABF较Control组可显著上调10个和下调35个血浆代谢物成分(P<0.05),涉及22条代谢通路;3.cs TKABF较NBM组可显著上调17个和下调包括锌指结构相关蛋白Zfyve16(R=0.75,P=0.008)和ZIP1(R=0.70,P=0.001)在内的26个蛋白质(P<0.05),涉及22条细胞信号通路;4.OVX较Sham组差异有统计学意义(P<0.05),并且OVX+TKABF较OVX组差异也有显著性(P<0.05),而与Sham组比较,差异无显著性(P≥0.05)的蛋白有17个,已知功能蛋白为9个,分别为(OVX+TKABF vs OVX)(P<0.05;R为变化倍数,R>1为上调,R<1为下调):LIFR(R=2.32,P=0.000)、CEH(R=1.92,P=0.003)和FGL2(R=0.47,P=0.012)、TSP-1(R=0.39,P=0.001)、CXCC/RTCK1(R=0.32,P=0.000)、PPlase(R=0.32,P=0.000)、PF4(R=0.29,P=0.000)、KIF(R=0.26,P=0.000)、CCDC60(R=0.24,P=0.000),未知功能蛋白有8个;5.OBM较NBM组有显著性差异(P<0.05),并且Cs TKABF+OBM较OBM组差异也有显著性(P<0.05),而较NBM组差异无显著性(P≥0.05)的mRNA有21个,已知功能基因为13个,分别为OVX+TKABF vs OVX:(Fold Change,FC值为调节倍数,“+”为上调、“-”为下调;P<0.05),):Brd1(FC=4.934,P=7.71E-31)、Zfp219(FC=2.649,P=6.72E-8)、Ahdc1(FC=2.020,P=3.68E-05)、Adra2a(FC=2.001,P=4.30E-5)、Uspl1(FC=1.882,P=0.000106)、Gatad2b(FC=1.572,P=0.001258)、Rfc1(FC=1.564,P=0.001069)、Hspb6(FC=1.38,P=0.00035)和Gcc2(FC=-3.056,P=2.92E-10)、Egr2(FC=-3.055,P=2.91E-13)、Col7a1(FC=-2.331,P=2.49E-06)、Jun(FC=-1.672,P=4.57E-75)、Hs6st2(FC=-1.618,P=0.000699),未知功能基因为8个。Cs TKABF+OBM较OBM组,差异具有显著性(P<0.05),并编码锌指结构域及其相关基因的直系同源物有:5个含KRAB锌指结构域基因、1个含CXXC锌指结构域基因、1个BTB锌指结构域基因、2个SLC39A81、1个SLC39A1以及Zn元素相关基因:1个MED15、1个KLF2以及1个TRAF3。结论:1.TKABF调控正常rBMSCs鞘脂信号通路可能与上调正常大鼠血浆代谢物二氢神经鞘氨醇有关;TKABF调控正常rBMSCs的磷脂酶D(Phospholipase D,PLD)信号可能与大量下调正常大鼠血浆Lyso PC与Lyso PE类代谢物有关;TKABF可下调正常大鼠血浆组氨酸(Histidine,His)水平;2.含卷曲结构域蛋白CCDC60上调可能为肾虚型OP模型的一个潜在靶标,TKABF可通过下调其表达水平改善去卵巢OP大鼠BMD;含GRIP和卷曲螺旋结构域Gcc2 mRNA表达水平上调可能为去卵巢对rBMSCs的影响特征之一,cs TKABF可通过下调其水平而促OP状态下rBMSCs骨向分化;含卷曲结构域蛋白可能为TKABF防治PMOP的一个重要靶点;3.cs TKABF可通过下调含FYVE锌指结构域蛋白Zfyve16和由SLC30A1基因编码的锌转运蛋白ZIP1促正常rBMSCs骨向分化;4.编码C2H2型锌指结构域基因Zfp219和GATA型锌指结构基因Gatad2b mRNA的表达水平下调可能为去卵巢对rBMSCs的影响特征之一,而cs TKABF可通过上调其表达水平而促OP状态下rBMSCs骨向分化;编码C2H2型锌指结构域基因Egr2 mRNA的表达上调可能为去卵巢对rBMSCs影响的又一特征,而cs TKABF可通过下调其表达水平而促OP状态下rBMSCs骨向分化;5.cs TKABF可通过调控5个含KRAB锌指结构域、1个含CXXC锌指结构域、1个BTB锌指结构域、2个SLC39A81、1个SLC39A1以及与Zn元素相关1个MED15、1个KLF2以及1个TRAF3基因直系同源物而促OP状态下rBMSCs骨向分化;含锌指结构域蛋白可能为TKABF防治PMOP的又一个重要靶点;6.TKABF可通过特异性调控多种锌指结构域亚型防治PMOP,可能与下调血浆His水平有关;这种特异性结合锌指结构域可能也与上调血浆二氢神经鞘氨醇参与的rBMSCs内鞘脂信号通路有关。其机制可能为TKABF由大量含Zn量丰富的补肾药组成;综上,TKABF可通过特异性调控含卷曲结构域和多种锌指结构域亚型蛋白或基因防治PMOP。