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钩藤,茜草科（Rubiaceae）钩藤属（Uncaria）植物,多年生藤本植物,为我国常用中药材。2020年版《中国药典》中收录了钩藤的5种基原:钩藤（Uncaria rhynchophylla）、毛钩藤（Uncaria hirsuta）、大叶钩藤（Uncaria macrophylla）、华钩藤（Uncaria sinensis）和白钩藤（Uncaria sessilifructus）。市场调研结果显示目前钩藤（U.rhynchophylla）为主要的种植和市场销售品种。华钩藤由于生境破坏等原因,野生资源已极难发现,在主流药材市场上也未见销售。市场仍有钩藤混伪品流通,且钩藤属植物种质资源鉴别和系统进化关系仍不甚清楚。钩藤鉴别研究与质量评价对保持品质稳定性和提高药剂可控性具有重要意义。本研究以钩藤及其近源植物为研究对象,对叶绿体全基因组测序并注释,结合其他茜草科叶绿体基因组,进行系统发育分析。同时,利用响应面法对钩藤总黄酮提取工艺进行优化,采用高效液相色谱法对18批不同产地的钩藤进行质量评价并建立指纹图谱。主要研究结果如下:1.对4种药典中规定的钩藤物种和1个近源种叶绿体全基因组测序并注释,结果显示,钩藤属植物的叶绿体基因组全长为153,780～155,177 bp,共编码131个基因,包括83～86个蛋白编码基因,37个t RNA和8个r RNA。5种钩藤叶绿体全基因组序列的GC含量差异较小,IR区的边界存在细微变化,长度范围为25,657 bp～25,690 bp。ycf1基因横跨SSC和IRa区域且与IRa区域发生重叠。白钩藤、毛钩藤和大叶钩藤的rps19基因跨越了IRb和LSC边界,与IRb区域发生重叠;钩藤和攀茎钩藤的rps19基因完全处于LSC区域,该区域的收缩和扩张导致钩藤叶绿体基因组长度发生变化。基于钩藤的叶绿体全基因组序列及其编码蛋白序列,使用最大似然法（ML）建立了茜草科13个物种的系统发育树。系统发育分析结果显示,钩藤属植物聚类良好,支持率均在95%以上;基于两种序列的系统发育树在拓扑结构上无显著差异;钩藤与攀茎钩藤的亲缘关系较近,毛钩藤和大叶钩藤的亲缘关系较近,白钩藤与上述两支的亲缘关系较远。基于钩藤属植物叶绿体全基因组序列计算其核苷酸多样性,筛选出Pi值＞0.015的高变序列分别为psb A-trn H,rps16-trn Q,atp H/atp I,psb L,trn V,cca A和ycf1,这些高可变区可在后续用作鉴定物种的DNA条形码。2.利用响应面法对钩藤总黄酮提取工艺的优化。以总黄酮质量浓度为响应值,在单因素实验的基础上研究其液固比、超声时间、乙醇浓度、超声提取温度、样品浸泡时间及其相互作用对提取所得总黄酮质量浓度的影响。结果表明,提取钩藤黄酮类化合物的最优条件为:浸泡时间为11.1 h,乙醇体积分数为41.8%,料液比为0.5:12.6,超声时间为2 h,超声温度为60℃。验证实验得到钩藤总黄酮浓度为880.91μg/m L,计算得出其提取量为0.88mg/g。验证结果表明,该方法能显著提高钩藤总黄酮量,说明利用响应面法优化的钩藤总黄酮提取工艺是稳定可靠、科学合理的。3.参照2020年版《中国药典》对不同产区的钩藤样品材料进行含水率、灰分、浸出物等的指标测定,进行质量评价。结果如下,样品灰分含量整体偏高,灰分含率范围为1.77%～4.10%,贵州地区样品S3灰分含率最高,湖南衡阳地区毛钩藤样品S10灰分含率最低。湖南怀化部分样品、江西樟树、四川广元、印尼地区的钩藤样品总灰分含率符合药典规定品质,毛钩藤的灰分含率明显低于钩藤。使用热浸法提取钩藤浸出物,测定浸出物含率。样品浸出物含率范围为7.38～13.28%,所有样品浸出物含率均＞6%,符合药典规定。江西樟树地区与广西柳州地区浸出物含率差异较大;湖南怀化、江西地区的样品浸出物含量偏低;其他产地浸出物含率均在10%左右,存在一定程度的差异。所有钩藤样品的含水率均＜10%,符合药典规定,含水率范围为5.05～8.68%,贵州黔东南地区样品含水率最高,湖南怀化地区样品含水率最低。不同产地和种质的钩藤含水率并无明显差异。4.采用高效液相色谱对18批不同产地的钩藤建立指纹图谱。以样品S1为参照,选择芦丁、钩藤碱、异钩藤碱为对照品绘制标准曲线。使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统对样品的色谱峰进行多点校正,建立钩藤指纹图谱共有模式图,结果显示,18批钩藤的高效液相色谱图共包括11个共有峰且分离度良好,相似度范围在0.269～0.966之间。除去毛钩藤S10后,其相似度范围在0.687～0.966之间,说明不同产地的钩藤能够保持一定程度的稳定性,不同品种的钩藤在成份上存在明显差异。使用共有峰峰面积对18批钩藤样品进行聚类分析,样品被分为2类。仅江西产药材S11单独聚类,其余钩藤样品都可被聚为一类,这表明不同产地、品种的中药钩藤的质量总体上较为稳定,此结果与相似度评价结果相似。