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目的心肌缺血再灌注损伤是在冠心病救治过程中导致心肌损伤加重的重要危险因素。本研究以心肌缺血再灌注模型大鼠为研究对象,以心肌细胞收缩相关骨架蛋白为切入点,在中医“治病求本”思想指导下,运用“标本配穴”方法选择“内关”、“足三里”、“关元”三个腧穴进行电针预处理,观察“标本配穴”电针预处理对心肌细胞中肌小节超微结构及骨架蛋白结蛋白(desmin)和α-辅肌动蛋白(α-actinin)表达的影响,探讨“标本配穴”电针预处理防治缺血性心脏病的可能作用机制,为针刺防治心肌缺血再灌注损伤提供实验依据。方法1.采用SPF级雄性SD大鼠,体重为220-250g,适应性喂养1周后随机分为5组,每组10只,共50只。即模型组(myocardial ischemia/reperfusion injury group,MI/RI组)、假手术组(sham operation group,SO组)、内关预处理组(MI/RI+PC6组)、足三里预处理组(MI/RI+ST36组)、标本配穴预处理组(myocardial ischemia reperfusion group with acupuncture pretreatment on Neiguan,Zusanli and Guanyuan,MI/RI+AP组)。2.MI/RI组、SO组均采用捆绑1次/天,每次捆绑20min,连续捆绑7天,第8天开胸后进行心肌缺血再灌注动物造模,缺血20min,再灌注40min;但SO组在第8天手术造模时只开胸穿线,不结扎左冠状动脉前降支。MI/RI+PC6组、MI/RI+ST36组、MI/RI+AP组均在造模前7天,每天同一时间对大鼠进行电针预处理,第8天行心肌缺血再灌注术。MI/RI+PC6组在造模前7天每天针刺大鼠双侧“内关”穴,同时在“内关”穴外侧旁开0.3cm-0.5cm处浅刺一针作辅助电极,与“内关”穴组成一对电极;MI/RI+ST36组在造模前7天每天针刺大鼠双侧“足三里”穴、同时在“足三里”穴外侧旁开0.3cm-0.5cm非穴处浅刺一针作辅助电极,与“足三里”穴组成一对电极;MI/RI+AP组在造模前7天针刺大鼠双侧“内关”、“足三里”及“关元”穴,同侧“内关”、“足三里”穴位组成一对电极,在“关元”穴外侧旁开0.3cm-0.5cm处浅刺一针作辅助电极,与“关元”穴组成一对电极。连接韩氏电针治疗仪,选用连续波,频率2Hz,强度1mA,通电20min。每日治疗1次,每次20min,共7天。第8天行心肌缺血再灌注术。3.在针刺预处理治疗结束后,第8天开始每组按照3ml/kg·BW腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠并气管插管,连接小动物呼吸机机械通气,开胸后于左心耳和肺动脉根部下方2mm处缝扎阻断左冠状动脉前降支造成左室前壁心肌缺血20min,然后开放左冠状动脉前降支恢复血供应再灌40min,造成MI/RI模型。分别记录结扎前、结扎20min,再灌注40min的心电图ST段改变情况。以ST段抬高大于0.2mv标志心肌缺血,ST段回落标志再灌注。4.在第8天行MI/RI造模成功后,对大鼠进行腹主动脉采血和心脏取材,用ELISA检测各组大鼠的心肌缺血标志物缺血修饰白蛋白(IMA)与脑利钠肽(BNP)的含量,用光学显微镜观察HE染色切片的心肌损伤程度,用高倍透射电子显微镜观察肌小节的超微结构,用蛋白质印迹法检测心肌细胞骨架蛋白结蛋白(desmin)和α-辅肌动蛋白(α-actinin)的表达情况,并对各组数据进行统计分析。结果1.大鼠心电图ST段数值比较:(1)结扎20 min与结扎前比较:除SO组,其余四组ST段数值都极显著地升高(P<0.01),表明各组心肌缺血模型造模成功。(2)再灌注40 min与结扎20min比较:除SO组,其余四组ST段数值均明显下降(P<0.05),再灌注后ST段明显回落,表明再灌注造模成功。(3)再灌注40min后:与MI/RI组比较,其余四组的大鼠ST段数值均极显著地下降(P<0.01);与MI/RI+PC6组比较,MI/RI+ST36组再灌注后ST段数值显著升高(P<0.05),MI/RI+AP组再灌注后ST段数值显著下降(P<0.05);与MI/RI+ST36组比较,MI/RI+AP组再灌注后ST段数值极显著下降(P<0.01)。说明电针预处理可降低心肌缺血再灌注的损伤程度,对心脏具有一定的保护作用,而标本配穴电针预处理组ST段数值回落得最明显,说明MI/RI+AP组对心脏的保护作用优于MI/RI+PC6组与MI/RI+ST36组。2.大鼠心肌组织的形态学比较:MI/RI组大鼠心肌损伤破坏最明显,纤维排列紊乱、水肿,间隙增宽,大部分心肌纤维有扭曲挤压、溶解、断裂的现象。心肌纤维凝固性缺血坏死,胞浆嗜酸性强,并伴有炎性细胞浸润,部分细胞核固缩丢失,甚至碎裂溶解。SO组大鼠心肌组织结构未见明显异常。MI/RI+AP组大鼠心肌组织结构轮廓完整,心肌纤维排列较为整齐清晰,心肌细胞伴有少量炎性细胞浸润,轻度间质水肿。MI/RI+AP组心肌组织形态学的病变改变程度轻于MI/RI+PC6组和MI/RI+ST36组。3.大鼠心肌缺血血清标志物浓度含量:(1)与MI/RI组相比较:SO组、MI/RI+PC6组、MI/RI+ST36组、MI/RI+AP组大鼠血清中IMA与BNP的浓度都显著降低(P<0.01)。SO组<MI/RI+AP组<MI/RI+PC6组<MI/RI+ST36组<MI/RI组。(2)与MI/RI+PC6组比较:MI/RI+ST36组大鼠血清中IMA的浓度明显升高(P<0.01)、BNP的浓度升高(P<0.05);MI/RI+AP组大鼠血清中IMA的浓度明显降低(P<0.01)、BNP的浓度降低不明显,无显著性差异(P>0.05)。(3)与MI/RI+ST36组比较:MI/RI+AP组大鼠血清中IMA与BNP的浓度显著降低(P<0.01)。4.大鼠心肌细胞中肌小节的超微结构比较:MI/RI组大鼠心肌损伤非常严重,肌原纤维萎缩、断裂、溶解,肌小节明、暗带结构区域严重破坏,呈现碎片状,排列模糊紊乱。M线弯曲或消失,部分细胞骨架甚至完全断裂,肌小节蛋白链的末端肌动蛋白丝断裂减少、分离溶解,细胞间质水肿、空泡变性。MI/RI+PC6组、MI/RI+ST36组较MI/RI组有轻度改善;MI/RI+AP组心肌细胞超微结构破坏较MI/RI组明显减轻,大鼠心肌肌原纤维排列较为整齐,肌丝清晰,基本无断裂,肌小节中明带、暗带结构清晰可见,分布均匀,Z线与M线清晰完整。5骨架蛋白desmin和α-actinin表达水平5.1骨架蛋白desmin灰度值比值含量:(1)与SO组相比:MI/RI组、MI/RI+PC6组、MI/RI+ST36组、MI/RI+AP组中的desmin表达明显降低(P<0.01);(2)与MI/RI组相比:MI/RI+PC6组、MI/RI+ST36组、MI/RI+AP组中的desmin表达明显升高(P<0.01);(3)与MI/RI+PC6组相比:MI/RI+ST36组中desmin表达降低,但无显著性差异(P>0.05),MI/RI+AP组中desmin表达升高,但无显著性差异(P>0.05);(4)与MI/RI+ST36组相比:MI/RI+AP组中desmin表达升高(P<0.01)。5.2骨架蛋白α-actinin蛋白灰度值比值含量:(1)与SO组相比:MI/RI组、MI/RI+PC6组、MI/RI+ST36组、MI/RI+AP组中α-actinin的蛋白表达都显著降低(P<0.01);(2)与MI/RI组相比:MI/RI+PC6组、MI/RI+ST36组、MI/RI+AP组中的α-actinin蛋白表达都显著升高(P<0.01);(3)与MI/RI+PC6组相比:MI/RI+ST36组中α-actinin的表达降低,但无显著性差异(P>0.05),MI/RI+AP组中α-actinin表达明显升高(P<0.05);(4)与MI/RI+ST36组相比:MI/RI+AP组中α-actinin表达升高(P<0.01)。结论1.“标本配穴”电针预处理可以对MI/RI模型大鼠心肌细胞或组织进行有效保护,促使心电图ST段回落,改善心肌组织受损的程度,降低血清中IMA与BNP的含量,从而降低心肌缺血再灌注损伤程度,达到保护心肌、改善心功能的目的。2.“标本配穴”电针预处理能明显稳定模型大鼠心肌细胞的肌小节结构,减少心肌纤维的损伤,改善心脏的收缩功能,对稳定心肌细胞骨架结构进行了良性诱导。3.电针预处理三组均能上调心肌细胞骨架蛋白desmin、α-actinin表达水平,但标本配穴预处理组上调更显著(MI/RI+AP组>MI/RI+PC6组>MI/RI+ST36组),说明MI/RI+AP组对心肌的保护效应更佳。