猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因及其原核表达产物的检测应用

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根据GenBank上公布的PRRSV ATCC VR2332株的核衣壳蛋白基因(N基因)的核苷酸序列,设计了一对引物,并应用RT-PCR方法扩增出了VR2332 resp株的目标基因片段。对扩增片段及pET-32a质粒分别用BamHI、Xho I两种酶进行消化,随后用T4DNA连接酶连接,将连接产物转化到BL21(DE3)中,再经双酶切鉴定后,即构建成功了重组质粒pETN。对转化的表达菌于30℃下培养至OD值0.5—0.6时用IPTG进行诱导表达,并对诱导条件进行优化,使核衣壳蛋白得到高效表达。 应用His-bind树脂层析柱纯化重组核衣壳蛋白,纯化产物经SDS-PAGE电泳鉴定其纯化效果,并用Western-blot检验其特异性。在此基础上,利用重组N蛋白作包被抗原,优化反应条件后,建立了检测猪繁殖与呼吸综合征血清抗体的重组N蛋白—ELISA试验,并将此方法应用于大量样品的检测,该方法与IDEXX公司ELISA试剂盒的检出符合率达91%。同时,我们也将纯化的N蛋白与乳胶颗粒吸附,建立了检测抗体的简便易行的间接乳胶凝集试验,该方法同ELISA试剂盒的检出符合率达78%。 本研究根据公布的PRRSV ATCC VR2332株的核衣壳蛋白基因与流感病毒血凝素基因(HA基因)的核苷酸序列,设计了一对引物,其中一条引物含有HA基因的主要核苷酸序列。经扩增、克隆后构建了重组质粒pETHN,并将其转化到BL21(DE3)中用IPTG诱导表达。表达产物经纯化后,与已被HA单抗致敏的乳胶结合,初步建立了检测血清的乳胶凝集试验。检测结果同前三种方法进行比较。 利用PRRSV核衣壳蛋白基因的高度保守性,运用RT-PCR方法对可疑的流产及死产胎儿进行检测,证明此方法可从病原学角度诊断PRRS。
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