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猪流感（Swine Influenza,SI）是由猪流感病毒（Swine Influenza Virus,SIV）引起的一种急性、接触传染性、群发性的猪呼吸道疾病,呈世界性分布。非结构性蛋白（Nonstructural protein,NS1）是A型流感病毒在感染期间发挥多种功能的蛋白。NS1的主要作用是抑制宿主免疫反应,特别是抑制干扰素（IFN）的产生和拮抗IFN诱导蛋白的抗病毒作用,如dsRNA依赖性蛋白激酶R（Double-stranded RNA-dependent protein kinase,PKR）和2’5’-寡腺苷酸合成酶（2’-5’oligoadenylate synthetase,OAS）,以维持病毒感染力。但不同亚型SIV的NS1蛋白发挥作用的关键氨基酸位点尚不是十分清楚。本研究以SIV A/swine/Shanghai/3/2014（H1N1）分离株为模板,利用定点突变技术对NS1蛋白的核定位序列（Nuclear localization sequence,NLS）和核输出序列（Nuclear export signal,NES）中重要氨基酸位点进行突变。通过反向遗传学技术拯救获得突变株,实验检测突变蛋白和突变病毒在细胞中的分布、对细胞因子转录水平的影响以及对小鼠的干扰素产生的影响,为深入了解NS1关键氨基酸位点作用奠定基础。选择NS1蛋白NLS和NES上5个保守关键氨基酸突变为丙氨酸,并插入pCAGGS真核表达载体中,构建5个突变体NS1质粒(NS1L36A、NS1R38A、NS1L141A、NS1L144A和NS1L146A),将突变体质粒分别转染HEK-293T、A549细胞,利用Western Blot证实,各突变体蛋白均真核表达成功。但它们在A549细胞中的定位不同,NS1L36A、NS1L141A、NS1L146A与野生型NS1蛋白相似,在细胞质和细胞核中均可检测到蛋白表达。而NS1L144A蛋白主要分布在细胞质中,不进核;NS1R38A有少量进入细胞核。表明,NS1蛋白中第144和38位氨基酸位点可能影响NS1蛋白定位。进一步检测发现,在第36h,各NS1突变蛋白在A549细胞内Ⅰ型干扰素β（type I interferonβ,IFN-β）和OAS转录水平相比于野生型NS1蛋白在A549细胞内Ⅰ型IFN-β和OAS转录水平,显著性上升（P<0.05）,其中NS1蛋白中第144和38位氨基酸位点转录水平较高,因此,推测NS1蛋白中第38位和144位氨基酸突变能降低NS1蛋白对宿主细胞抗病毒免疫应答的抑制作用。为了进一步验证本研究结果,利用SIV的反向遗传学平台,分别拯救了野生型病毒和点突变病毒,命名为rSIV,rSIVNS1R38A,rSIVNS1L144A。病毒生长曲线显示突变病毒rSIVNS1R38A、rSIVNS1L144A和野毒rSIV的生长特性相类似,但rSIVNS1R38A和rSIVNS1L144A的病毒滴度下降,表明这两个氨基酸位点的突变可能会影响病毒的复制能力,但拯救的病毒NS1蛋白在MDCK细胞中的定位与野生型病毒基本一致,在病毒感染后48小时,在细胞质和细胞核中均有分布。其中在12h,三株重组病毒引起OAS-1转录水平上升,24h时两株突变株rSIVNS1R38A、rSIVNS1L144A引起OAS-1转录水平与野毒rSIV引起OAS-1转录水平相比具有差异性（P<0.05）。两突变病毒rSIVNS1R38A和rSIVNS1L144A在A549细胞中引起IFN-β转录水平相比于rSIV IFN-β转录水平显著性上升（P<0.01）,且与病毒滴度呈负相关。将rSIV、rSIVNS1R38A和rSIVNS1L144A滴鼻接种小鼠,小鼠不发病,但感染rSIV小鼠体重下降明显。小鼠鼻腔和肺脏组织中均可检测到病毒,其中rSIV在小鼠肺脏中的病毒滴度高于rSIVNS1R38A和rSIVNS1L144A。肺脏中干扰素α（type I interferonα,IFN-α）、OAS-1、IFN-β和肿瘤坏死因子α（Tumour necrosis factor-α,TNF-α）水平均上调。且与肺脏病毒滴度呈负相关。结论,本研究证实猪流感A/swine/Shanghai/3/2014（H1N1）毒株的NS1蛋白中第38位和144位氨基酸位点是病毒NS1蛋白抑制干扰素产生的关键氨基酸位点,本研究为进一步研究NS1蛋白在抑制细胞先天性免疫应答中的作用奠定基础。