论文部分内容阅读
[研究背景和目的]急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction, AMI)已成为心血管疾病中死亡率不断增加的重要原因。心力衰竭是心肌梗死常见并发症,也是导致死亡的主要原因。因此,急性心肌梗死的早期、及时、准确的诊断,及对病情的积极主动评估,是采取积极有效的治疗措施,保证心脏及时再灌注、减少死亡率的必要条件。心肌梗死后心肌细胞凋亡、心室重构等是心衰发生的中间环节,也是病变修复和整体代偿的重要病理生理过程。近十年来新发现的非编码RNA——microRNA(miRNA)与各种疾病的发生和发展及预后有紧密联系。且miRNA在血液中具有较高的稳定性,miRNA通过抑制靶基因表达来参与心肌凋亡重构过程,对心肌细胞生长或凋亡、细胞外基质重构等产生关键作用,从而参与心力衰竭的发生过程。心肌梗死急性期有多种循环miRNA表达异常。最新研究发现miR-499aa在心肌细胞中高表达,在调节AMI后心肌细胞的抗凋亡、梗死面积的缩小、心功能的恢复等具有重要作用,因此有望作为AMI辅助诊断以及预测患者的预后的重要标记物。但对于其变化的规律和影响的因素尚不清楚。目前主要用于鉴定miRNA水平的方法有基因芯片技术、Northern blots和荧光定量PCR技术等。本研究的主要目的是研究心肌梗死后患者循环中miRNA-499a的表达水平的动态变化,分析其与心肌损伤标志物以及心功能之间的关系,探讨其对患者心肌梗死后心力衰竭可能的预测作用。并探究miRNA-499a表达水平的改变在体外培养的人心肌细胞中发挥作用的分子机制,为提早干预,改善受损的心功能提供新的诊断和治疗思路。[研究方法]血清标本收集于2013-2014年上海市杨浦区中心医院急性心肌梗死的急诊住院病人,共20例,其中每例病人分别于急性心梗发作后24小时、48小时、72小时和96小时采血。所有患者自入院起均监测心肌酶谱、心功能、生化指标、心电图、临床症状与体征以及预后的情况。另有20例健康人,作为对照组。健康体检对照入选标准：无心血管病史,心电图、胸片、肝肾功能正常,排除合并感染、肿瘤等。将用来生产慢病毒的293T细胞株培养于DMEM培养基中；将用于双荧光素酶报告基因实验的HEK293细胞培养于DMEM培养基中；人原代心肌细胞,培养于专用的心肌细胞培养基。使用miRNeasy miRNA抽提试剂盒抽提血清标本中的miRNA。使用qPCR法定量检测血清中miRNA-499a的表达水平。制备miRNA-499a上调、下调慢病毒进行体外研究。优化慢病毒侵染人原代心肌细胞的侵染条件。分别使用miRNA-499a上调、下调慢病毒液侵染人原代心肌细胞,构建miRNA-499a上调、下调的心肌细胞模型。使用miRNA靶基因预测在线数据库MICRORNA.ORG、MIRDB和TargetScan预测miR-499a-5p的靶基因。预测结果取交集,再根据人工判读,最终选取SOX5和SOX6基因作为候选验证靶基因。分别构建SOX5和SOX6的3’UTR区报告基因质粒,及相应的靶位点缺失3’UTR区报告基因质粒。使用双荧光素酶报告基因实验,检测miRNA-499a与SOX5和SOX6是否存在着调控关系。在niRNA-499a上调、下调的心肌细胞模型上,使用qPCR检测miRNA-499a的表达水平。同时,使用Western blot检测SOX6蛋白的表达水平。荧光定量PCR实验中使用基因相对表达量公式计算miRNA-499a的表达。双荧光素酶报告基因实验用Firefly荧光强度均值除以Renilla荧光强度均值,计算相对荧光强度。Western blot实验使用Gel-Pro analyzer软件计算电泳图片中蛋白条带的灰度值,用目的蛋白(灰度值)除以内参beta-actin蛋白来计算目的蛋白相对表达量。[研究结果]1.在20例患者的血清样本中,miR-499a的表达水平呈现出先升高(24h为峰值)再下降的变化模式。健康对照组血清样本miR-499a则呈现出稳定、相对较低的表达水平,见表4。2.在双荧光素酶报告基因实验中,空白对照组和阴性对照组均表现出相对荧光强度不随miRNA-499a表达上升而变化的现象,表明我们的实验稳定性良好。当]miRNA-499a达水平升高时,SOX5野生型3’UTR和突变型3’UTR组均未表现出相对荧光强度的变化。当miRNA-499a表达水平升高时,SOX6野生型3’UTR表现出相对荧光强度减弱,而突变型3’UTR组未表现出相对荧光强度的变化。3.使用Western blot方法检测:miRNA-499a上调、下调人原代心肌细胞模型中的SOX6蛋白的相对表达水平。发现在miRNA-499a上调人原代心肌细胞模型中,SOX6蛋白的表达水平明显下降；而在miRNA-499a下调人原代心肌细胞模型中,SOX6蛋白的表达水平明显上升。4.循环miR-499表达与血清CK-MB的变化趋势一致,24小时时的CK-MB与循环niR-499a的表达很可能相关。5.循环miR-499a的表达在发生心衰的患者中明显低于未发生心衰患者。单独应用循环miR-499a诊断急性心梗患者发生心衰,24小时ROC曲线下的面积(AUC)为0.86,提示其可能作为早期诊断心衰的敏感指标。[研究结论]循环miRNA-499a的变化与心肌损伤的标志物CK-MB相一致,在心衰患者中表达较低,提示其可能可用于患者心肌梗死后心肌损伤程度的监测以及预后的新型检测指标。miRNA-499a对SOX6存在着明确的调控关系。提示miRNA-499a可能通过SOX6调控其下游信号通路的开关,参与心肌梗死后心肌细胞凋亡和心室重构的病理生理过程而发挥作用。