肝癌局部组织微环境中免疫抑制细胞(FoxP3+Treg、中性粒细胞)以及缺氧诱导的HIF-1α介导的糖酵解效应在癌细胞的增殖、侵袭中发挥促进作用,其具体的作用机制仍不清楚;我们在既往研究中证实,调节性T细胞与肝癌的肿瘤分化及预后呈负相关关系,并发现西罗莫司联合槐耳颗粒及胸腺法新有助于预防肝癌移植术后肿瘤的复发,并通过大鼠肝癌模型证实局部组织和外周血高表达的FoxP3+Treg通过分泌IL-10与TGF-β抑制T细胞的功能诱导肿瘤的生长,同时西罗莫司为主的联合治疗可降低FoxP3+Treg的表达,抑制肿瘤的生长,然而具体的分子作用机制仍有待进一步研究,以及是否调控中性粒细胞及缺氧诱导的HIF-1α通路对肿瘤生长的促进作用,仍未可知;本课题旨在既往研究的基础上进一步探讨FoxP3+Treg、中性粒细胞以及HIF-1α介导的糖酵解效应与肝癌预后及分化的相关性,分析影响肝癌预后的危险因素;与此同时在细胞分子水平,探索缺氧诱导的HIF-1α通路异常激活效应对HepG2增殖的的调控机制,并同时研究西罗莫司为主的联合治疗抗癌生长的分子机制及其对HIF-1α信号通路效应的调控作用,以期为临床治疗提供依据,并对西罗莫司为主的免疫方案在肝癌肝移植患者长期生存中的价值进行评估。基于此,本研究主要分为三大部分进行,主要的研究目的、内容如下:第一部分:中性粒细胞、FoxP3+Treg及糖酵解异常与肝癌肿瘤免疫及预后相关性分析目的:1,分析不同分化肝癌中中性粒细胞的表型;2,研究CD274+NEUT、FoxP3+Treg、NLR与肝癌预后的相关性;3,缺氧诱导的HIF-1α信号通路介导的糖酵解效应与肝癌的相关性分析;4,Cox回归模型分析影响肝癌临床预后的风险因素。方法:以NLR cutoff值纳入临床病理确诊的136例肝癌患者为研究对象,分为高-中分化组与低分化组,流式细胞技术检测外周血及癌组织中中性粒细胞(NEUT)的表达水平及表型分析(CD62L与CD274)、FoxP3+Treg及淋巴细胞亚群绝对计数,分析CD274+NEUT、FoxP3+Treg表达水平与肿瘤分化的相关性及其对CD8+T细胞的影响和IL-10、TGF-β细胞因子水平,探讨二者在肝癌发生中的作用;并同时以免疫组化染色检测癌及癌旁组织中CD274(PDL-1)、FoxP3,p-Akt与p-mTOR,PTEN与p27,HIF-1α及糖酵解中LDHA、GLUT-1,VEGF蛋白的表达,分析与肿瘤分化程度的相关性,探讨HIF-1α在肝癌发生中的作用机制;对两组患者的预后生存进行单因素预后分析,然后以COX风险回归模型分析影响肝癌患者预后生存的危险因素。结果:(1)肝癌外周血及癌组织中FoxP3+Treg表达显著上调,且低分化肝癌表达水平显著升高(P<0.001),不同分化程度肝癌患者外周血及组织中CD274+CD62L+CD15+NEUT(CD274+NEUT)水平在低分化肝癌患者中显著高表达(P<0.001),荧光强度差异显著(P=0.021),并与FoxP3+Treg表达呈正相关(r = 0.58,P<0.0001);同时NLR在不同分化肝癌患者中的表达均存在显著差异(P<0.01),且与FoxP3+Treg及CD274+NEUT表达均呈正相关关系(P均<0.001),同时发现低分化组肝癌患者外周血CD8+T细胞的表达水平显著低于高分化组患者,且抑制性细胞因子IL-10与TGF-β显著增高(P均<0.01);(2)免疫组化中,CD274(PDL-1)、FoxP3,p-Akt、p-mTOR、HIF-1α、LDHA、GLUT-1、VEGF、PTEN、p27 蛋白的平均光密度(MIOD)表达在癌组织中均高于癌旁组织(P<0.01),且对不同分化程度肝癌而言,低分化肝癌患者高表达CD274(PDL-1)、FoxP3,p-Akt、p-mTOR、HIF-1α、LDHA、GLUT-1、VEGF,且均与高-中分化患者存在显著差异(P均<0.01),同时p27与PTEN的表达显著低于高-中分化肝患者(P<0.01);(3)、单因素生存分析提示不同分化程度肝癌患者预后生存时间存在显著差异,低分化患者生存时间相对较短;多因素COX风险回归模型分析,提示NLR、CD274+NEUT、FoxP3+Treg是影响肝癌预后的独立危险因素,P值分别为0.024;0;0.006;相对危险对RR及95%CI分别为 1.362-(1.085-1.709);2.631-(2.091-3.310);1.409-(1.105-2.798),并对 NLR 与肝癌病理Ki67%指数为主变量分析发现,二者均是影响预后的独立危险因素(P=0),RR 值分别为 1.225 和 1.396;95%CI(1.027-1.041)-(1.277-1.446)。结论:(1)FoxP3+Treg、CD274+NEUT与肝癌分化程度呈负相关关系;并能通过分泌IL-10、TGF-β抑制CD8+T细胞杀伤效应,发挥促癌作用;(2)癌组织中浸润的CD274(PDL-1)、FoxP3及HIF-1 α与肝癌的分化程度密切相关;可能通过增加糖酵解效应中LDHA、GLUT-1的表达促进,降低PTEN的表达促进肿瘤生长;(3)Cox风险回归分析证实,NLR、CD274+NEUT、FoxP3+Treg以及Ki-67%是肝癌预后的独立危险因素。第二部分:西罗莫司、槐耳清膏抗肿瘤机制及其调控HIF-1α对肝癌增殖、侵袭的影响目的:1,细胞水平分析西罗莫司、槐耳清膏抑制HepG2生长、增殖的机制;2,分析缺氧诱导的HIF-1α信号通路介导的糖酵解效应对HepG2增殖的促进作用;3,分析西罗莫司、槐耳清膏抗癌的分子机制及对HIF-1α调控作用;4,细胞间相互作用,佐证西罗莫司为主的联合治疗对效应T细胞杀伤肿瘤的作用。方法:以人源性肝癌细胞系HepG2为研究对象,分常氧组及乏氧组,以西罗莫司、槐耳清膏为干预手段,分析乏氧对细胞增殖的调控作用,在细胞水平借助MTS细胞增殖实验与细胞划痕实验分析其对HepG2生长增殖和侵袭的抑制作用,并以流式细胞技术分析药物干预对HepG2凋亡及细胞周期的影响;同时分析药物干预对乏氧条件下HepG2细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响;在此基础上,同时联合LY294002及KC7F2为干预措施,以RT-PCR检测肿瘤生长、增殖信号通路相关基因表达及对缺氧诱导的HIF-1α信号通路介导的糖酵解效应的调控,探讨西罗莫司联合槐耳清膏抑制肝癌生长、增殖的分子机制;然后在上述结果的基础上,以磁珠分选CD8+T和CD4+T细胞,刺激诱导Treg,在药物干预条件下,与HepG2共培养,分析药物干预对T细胞肿瘤免疫应答的影响。结果:(1)槐耳清膏 8mg/ml(H8)及西罗莫司 50nM(S50)、LY29400225μM(Ly-25)可显著抑制HepG2细胞的增殖(P<0.05),乏氧下KCF7220μM(KC7)干预具有抑制HepG2增殖的效应(P<0.05);(2)划痕实验提示,与S50联合Ly-25、KC7及Ly-25+KC7相比,S50+H8可显著抑制HepG2的侵袭(P<0.001),且具有时间-剂量依赖性;(3)S50、H8可显著促进HepG2细胞发生凋亡,凋亡率可达70-80%左右(P<0.001),乏氧环境下,S50、H8仍具有显著的促进HepG2细胞凋亡效应,凋亡率可达60-70%左右(P<0.001),但较常氧水平明显下降(P<0.001),提示乏氧可促进HepG2细胞增殖的作用;(4)与S50、H8相比,S50+H8可显著抑制HepG2细胞停滞在S/G2期,且差异显著(P<0.05),乏氧条件下,S50+H8组S/G2期细胞比例较SRL组增加,与槐耳清膏无显著区别,但均较常氧组较少(P<0.05);(5)RT-PCR结果提示,CoC12模拟乏氧环境,可激活HIF-1α累积增加,上调LDHA、GLUT-1 mRNA的表达,下调PTEN、p27mRNA表达,上调Akt/mTORmRNA的表达,同时VRGF、FoxP3mRNA的表达增加,而与单药组相比,S50+H8干预可显著下调常氧与乏氧条件下,Akt/mTOR mRNA及HIF-1 α mRNA的表达水平,并显著减少VEGF、FoxP3 mRNA 的表达,同时,联合阻断 PI3K/Akt/mTOR 及 HIF-1α,对 Akt/mTOR、HIF-1α、LDHA、GLUT-1 mRNA下调表达效应增强,并进一步下调PTEN、p27及VEGFmRNA表达,差异显著(P<0.001);(5)与PBMC细胞共培养,S50+H8增加HepG2细胞的凋亡,同时联合CD8+T共培养,胸腺法新可增强CD8+T细胞对HepG2的杀伤效应;联合Treg培养可减弱CD8+T细胞对HepG2的杀伤效应(P<0.005)。结论:(1)Cocl2 模拟缺氧可激活 PI3K/Akt/mTOR-HIF-1α 和 HIF-1α-PTEN-Akt 通路上调HIF-1α介导的糖酵解效应,促进HepG2细胞的增殖与侵袭;(2)西罗莫司为主的联合治疗可以下调缺氧诱导的HIF-1α积累表达,并减弱HIF-1α介导的糖代谢增强效应,并通过PI3K-Akt-mTOR-HIFα及HIF-1α-PTEN-Akt/mTOR通路发挥抗肿瘤效应;(3)S50+H8联合胸腺法新可下调Treg对CD8+T细胞的抑制作用,抑制癌细胞的增殖。第三部分西罗莫司为主的联合免疫方案在肝癌肝移植术后移植物长期生存中的价值研究---5年随访结果目的:探讨西罗莫司联合槐耳颗粒及胸腺法新方案在肝癌肝移植术后移植物长期生存中的安全性和有效性。方法:超UCSF标准的晚期肝癌肝移植患者36例,分为RAPA联合组与对照组,RAPA组接受RAPA联合槐耳颗粒和胸腺法新治疗;对照组接受CINs方案治疗。结果:RAPA联合组生存时间(P<0.0001)和复发时间显著延长(P=0.008);术后两组1、3、5年的总生存率和无瘤生存率分别为(OS,1-年:100%,3-年:94.4%,5-年:55.6%;DFS,1-年:88.9%,3-年:77.8%,5-年:50.0%);与对照组和术前相比,术后1年,RAPA联合组AFP与FoxP+Treg水平显著降低。此外,RAPA组换,术后FoxP3+Treg和FoxP3+Treg/CD8+T的比值显著降低(P<0.001),而CD8+/CD3+T的比值显著增加(P<0.001)。对于肿瘤复发患者,AFP和FoxP3+Treg显著增加,治疗趋于稳定后,逐步降低至正常水平。结论:对超UCSF标准晚期肝癌患者,术后早期应用RAPA为主的联合免疫治疗方案干预可以延长患者生存时间,延缓肿瘤的复发,临床安全有效,为肝癌肝移植术后肿瘤复发防治提出新的思路。