兔球虫病是由艾美耳属的多种球虫所引起的严重危害养兔业的一种寄生性原虫病。在国内目前已报道的17种兔球虫中,斯氏艾美耳球虫(Eimeria stiedai)的致病力最强且危害最大,寄生于兔胆管上皮细胞,可引起严重的肝球虫病。当前对于兔球虫病的控制主要是依靠化学药物,然而随着球虫耐药性和药物残留等问题的出现,使抗球虫药物难以从根本上解决球虫的威胁。究其原因是缺乏对兔球虫细胞和分子生物学特性的了解。斯氏艾美耳球虫病毒的发现为兔球虫分子生物学特性的研究提供了新的方向。原虫病毒是ds RNA病毒(Double-stranded RNA viruses),属于全病毒科,在许多寄生性原虫内发现了病毒的存在,例如,贾第虫、阴道毛滴虫、利什曼原虫及艾美耳属球虫。研究表明,利什曼原虫病毒可以通过激活宿主的TRL3信号通路,促进利什曼原虫的持久性感染。另外,还有一些研究表明,ds RNA病毒能够增加原虫的致病性。此外,病毒RNA介导的转染载体已经在蓝氏贾第虫中实现了基因表达调控和蛋白功能的研究。虽然,病毒样粒子已在斯氏艾美耳球虫中发现,但尚无关于斯氏艾美耳球虫病毒的全基因组序列和分类的报道。本研究首次对斯氏艾美耳球虫病毒基因组序列进行了克隆、测序及分析,并构建了斯氏艾美耳球虫病毒转染载体。本研究为了解兔球虫的分子生物学特性提供了新思路。斯氏艾美耳球虫病毒全长c DNA的克隆及序列分析:根据已知病毒的保守序列设计简并引物,通过RT-PCR及SMART RACE技术成功获得了斯氏艾美耳球虫病毒基因组的全长序列。测序结果显示,病毒基因组全长为6219 bp,包含两个开放阅读框,且在两个开放阅读框的交界处存在四个碱基的转换片段(AUGA)。ORF1长为2400 bp,编码病毒衣壳蛋白(799个氨基酸);ORF2长为3303 bp,编码病毒RNA依赖的RNA聚合酶(1100个氨基酸)。BLASTp分析发现斯氏艾美耳球虫病毒与E.tenella RNA virus 1(Et RV1)的氨基酸序列同源性最高。斯氏艾美耳球虫病毒基因组具有全病毒科的典型特征,可认定为全病毒科的一个新种。斯氏艾美耳球虫病毒序列的生物信息学分析:将获得的Es RV基因组序列和Totiviridae病毒科的病毒序列进行多重序列比对后,构建进化树。进化树分析显示,Es RV、Et RV1及Eb RV1形成一个独立的分支,而与其它的原虫病毒距离较远,因此应将Eimeriaviruses划分为Totiviridae家族的一个新属。密码子偏好性分析表明真菌病毒比原虫病毒具有更高的宿主适应性,而原虫病毒中的GLV和Et RV1的宿主适应性远超其它原虫病毒。通过Cp G岛和启动子区域预测,显示在coat和Rd Rp编码框上游具有独立启动子。Rd Rp蛋白结构预测显示,具有palm,fingers和thumb结构域。斯氏艾美耳球虫不同发育阶段病毒蛋白的表达研究:从感染斯氏艾美耳球虫不同时期的兔肝脏中收集斯氏艾美耳球虫裂殖子、配子体及未孢子化卵囊,体外进行孢子化孵育后,收集斯氏艾美耳球虫孢子化卵囊,分别提取m RNA和蛋白样品。对提取的样品进行RT-PCR和Western blot分析。结果显示,Rd Rp蛋白在斯氏艾美耳球虫的四个不同发育阶段均可以表达;而coat蛋白仅在斯氏艾美耳球虫卵囊形成及孢子化阶段的虫体内表达。斯氏艾美耳球虫病毒载体的构建:以斯氏艾美耳球虫病毒基因组序列为基础,参照相关病毒载体的构建策略,将绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因替换斯氏艾美耳球虫病毒部分序列,构建斯氏艾美耳球虫病毒载体。通过电穿孔技术将构建的斯氏艾美耳球虫病毒载体转入未孢子化的斯氏艾美耳球虫卵囊内。通过激光共聚焦扫描、流式细胞术和Western blot检测,研究表明报告基因GFP在斯氏艾美耳球虫传代的第二代和第三代虫体中均得到表达。综上所述,本研究对了解斯氏艾美耳球虫病毒的基础特征及研发斯氏艾美耳球虫的基因操作工具,具有重要的意义,同时斯氏艾美耳球虫病毒载体的构建为研究球虫细胞和分子生物学特性奠定了重要基础。