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目的:原发性肝癌是我国发病率和死亡率较高的恶性肿瘤,严重危害人类公共健康。在诸多诱发肝癌的风险因素中,氧化应激是肝脏损伤逐渐演变为肝细胞癌发病机理中的主要因素。而肝癌以细胞的过度增殖为特点,在快速生长过程中,导致局部组织低氧或缺氧,从而使肿瘤细胞氧化还原失衡。在此应激状态下,线粒体作为氧化应激作用的重要靶细胞器,其功能可能发生改变甚至形成损伤。研究证实,机体依靠自身增长的抗氧化应答的活性因子来应对缺氧。肝再生增强因子(augmenter of liver regeneration,ALR)由于具有巯基氧化酶的特征,可通过调节氧化应激及凋亡基因表达发挥保护线粒体作用,而核转录因子NF-E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)是调节氧化应激反应的重要转录因子,能够显著诱导机体的内源性抗氧化应答,两者在抵抗外来化学物所诱发的氧化损伤、维持机体细胞内正常的氧化还原平衡稳态等方面发挥重要作用。有研究提出,Nrf2信号通路可上调其下游抗氧化蛋白及解毒酶的表达,其中ALR可能受到Nrf2的调控,但两者之间有无关联目前尚无明确证据,Nrf2通过何种方式启动对ALR的调控,其机制尚不清楚。我们拟通过本研究找出两者之间的调控机制,进一步深入研究ALR对受损线粒体有无修复的作用。方法:运用pAd Easy-1和RNAi技术分别构建重组腺病毒Nrf2过表达体系与Nrf2干扰体系,采用定量逆转录-聚合酶链式反应(Quantitative reverse transcription–polymerase chain reaction,qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot,WB)的方法,观察在常氧状态下PLC细胞中加入过表达Nrf2腺病毒、Nrf2-siRNA后,ALR有无表达变化。运用氯化钴制造PLC肝癌细胞缺氧模型,并利用胡芦巴碱(Trigonelline,Trigl)来阻断Nrf2在缺氧状态下的转位。在缺氧状态下使用qRT-PCR、WB、免疫荧光技术(Immunofluorescence technique,IF)来观察Nrf2的定位及Nrf2与ALR的表达变化,进而明确在缺氧状态下ALR是否受到Nrf2的调控。在PLC细胞缺氧并且Nrf2转位受到阻断的情况下,通过ATP(Adenosine Triphosphate)检测、线粒体膜电位检测、透射电镜扫描等方法观察线粒体的损伤情况。最后,应用pBudCE4.1载体来构建23KDa ALR过表达质粒。将ALR过表达质粒和对照质粒转入线粒体已受损的PLC细胞中,分别进行ATP检测、线粒体膜电位检测、透射电镜扫描、WB检测线粒体相关蛋白:细胞色素C(Cytochrome,Cyt C)、细胞凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor,AIF)、Bcl-2(B-cell lymphoma-2)、Bax(BCL2-Associated X Protein),以及线粒体转录因子A(mitochondria transcription factor A,mtTFA)的mRNA和蛋白表达水平,以期比较两组线粒体的功能是否有改变,ALR过表达质粒的转入对受损线粒体有无修复的作用。结果:我们成功构建了重组腺病毒Ad-Nrf2和Nrf2-siRNA,经qRT-PCR和WB验证,Nrf2 mRNA水平和蛋白表达得到增强/抑制。然而在常氧状态下,无论Nrf2表达如何变化,ALR的mRNA水平和蛋白表达并无相应变化。我们运用氯化钴诱导PLC细胞缺氧,经过浓度筛选和低氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1α)的有效表达,成功构建出PLC细胞缺氧模型。在此基础上,经过WB及IF的检测,可以观察到Nrf2在缺氧状态下,由细胞浆转位进入细胞核。在缺氧状态下加入胡芦巴碱后,经WB检测,可发现Nrf2蛋白在胞浆中的表达高于胞核,而IF检测观察到Nrf2仍然定位于细胞浆,说明胡芦巴碱成功阻断了Nrf2的转位。ALR蛋白表达在PLC细胞缺氧状态下表达增强;在缺氧胡芦巴碱阻断组中,ALR蛋白表达减弱,说明Nrf2转位受到阻断后,也阻断了对ALR的调控,ALR基因的表达受到抑制。通过对比PLC细胞缺氧组和缺氧/trigl组线粒体的功能指标,发现hypoxia/trigl组ATP、膜电位水平较缺氧组低,透射电镜也发现hypoxia/trigl组线粒体形态的损伤较缺氧组更为严重,说明抑制了Nrf2转位入核,细胞缺少Nrf2抗氧化应激的保护,由此线粒体受到的损伤更为严重。在验证了ALR过表达质粒(pBudCE-ALR)的有效性后,将其和空载体(con)分别转入hypoxia/trigl组中,通过检测发现,hypoxia/trigl/ALR组的ATP水平及膜电位表达较hypoxia/trigl/con组高,差异具有统计意义(P<0.001)。hypoxia/trigl/ALR组和hypoxia/trigl/con组对比,Cyt C、AIF在线粒体中的表达增多,Bcl-2蛋白的表达增强,Bax蛋白表达下降,差异均具有统计意义(P<0.001)。mtTFA mRNA和蛋白水平有增加。透射电镜显示,hypoxia/trigl/ALR组的线粒体形态较hypoxia/trigl/con组相比,线粒体固缩、嵴紊乱有一定改善。以上实验均证明了ALR对受损线粒体能起到修复的作用。结论:在缺氧等应激状态下,Nrf2转位入核后启动对ALR基因的调控,两者在肝癌细胞中共同发挥抗氧化应激的作用。缺氧状态下阻断Nrf2转位,ALR表达下降,线粒体受到的氧化打击更为严重。23KDa ALR不但能在氧化应激状态下保护线粒体,还能使已经受到损伤的线粒体得到一定程度上结构和功能的修复,为ALR参与肝癌细胞的抗氧化应激提供了新的证据。