Hic-5与肝内胆管结石病肝组织纤维化关系的研究

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目的:本实验收集纤维化肝组织和正常肝组织,对肝脏组织标本做HE染色和Masson染色,光镜观察组织的纤维化程度;Real-time PCR检测肝组织中I型胶原、Ⅲ型胶原、Hic-5、α-SMA、TGF-βl基因mRNA表达丰度;免疫组织化学及Western-blot检测肝脏组织标本中Hic-5、α-SMA、TGF-βl的表达量;探寻Hic-5在肝纤维化发病机制中的作用。方法:1、选取的80例肝脏标本,其中60例为手术切除的肝内胆管结石患者的肝脏组织,20例为手术切除的血管瘤患者瘤旁正常肝组织。2、通过HE染色对纤维化肝组织的纤维化程度进行分组。胶原纤维Masson染色测定纤维化肝组织胶原纤维沉积面积。统计分析术前患者空腹12小时以上血清生化和凝血指标。3、Real-time检测肝组织中I型胶原、Ⅲ型胶原、Hic-5、α-SMA、TGF-βl基因mRNA表达丰度。4、免疫组织化学法(SP法)及Western blot法检测肝脏组织Hic-5、α-SMA、TGF-βl蛋白表达情况。免疫组织化学结果采用Imagepro-IPP图像系统半定量测定Hic-5、TGF-β1和α-SMA的光密度值。Western blot结果用Bio-Rad凝胶摄像分析系统扫描入计算机中,凝胶定量分析软件Quantity One分析其灰度值。5、统计工具用SPSS17.0统计学软件。用均数±标准差(ˉx±s)来分析计量资料,单因素方差分析或Krusksl-Wallis H秩和检验来分析组间差异,多个样本均数间比较采用SNK法检验,计数资料采用卡方检验。变量相关性采用Pearson相关分析。取双侧α=0.05为检验水准,P<0.05则有统计学意义。结果:1、正常组与肝纤维化组之间肝功能指标及凝血指标分析:ALT、AST、TBIL、DBIL和IBIL纤维化组明显高于正常组,统计学分析显示差异有统计学意义,P<0.05。PT、INR、APTT、TT、PBG在正常组与肝纤维化组比较差异亦无统计学意义(P>0.05)。2、Real-time分析显示,各组间Hic-5、α-SMA、TGF-β1、ColⅠ、ColⅢmRNA表达比较:在正常组与肝纤维化组间,随肝纤维化程度加重表达逐渐增高,纤维化程度越重,mRNA表达越强。3、免疫组织化学显示,Hic-5、α-SMA、TGF-β1的光密度值在正常组与肝纤维化组间均表现为随肝纤维化程度加重逐渐增高,在重度纤维化肝组织中光密度值最高。正常组与肝纤维化组两两之间进行相关性分析,r值均大于零,Hic-5、TGF-β1、α-SMA的表达呈高度正相关,r=0.986,P<0.001(Hic-5与α-SMA); r=0.984,P<0.001(Hic-5与TGF-β1);r=0.961,P<0.001(α-SMA与TGF-β1)。4、Western blot分析表明,在正常组与肝纤维化组中Hic-5、α-SMA、TGF-β1蛋白表达均随纤维化程度加重而逐渐增加,在重度纤维化肝组织中蛋白表达量最高。结论:1、Hic-5和TGF-β1参与了胆汁淤积导致的肝脏纤维化发展过程。2、在肝内胆管结石患者中,随着肝纤维化程度的加重,Hic-5、TGF-β1和α-SMA表达加强。3、在胆汁淤积导致的肝脏纤维化中,Hic-5和TGF-β1的表达呈正相关,两者可能存在调控关系。
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