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奶牛乳房炎是奶牛乳腺的一种炎症,它的发生是病原微生物、环境因素、管理因素、奶牛自身及遗传因素等综合作用的结果。奶牛乳房炎是对奶业生产造成巨大损失的疾病之一,严重影响世界奶牛业发展,在畜牧、兽医、食品等领域一直受到广泛关注。随着生物技术的发展不断有新的技术被用来探索乳房炎的发病机理,本实验运用蛋白质组学的方法,鉴定健康与患乳房炎奶牛血浆中的差异蛋白,以及分娩前后血浆中的差异蛋白,旨在寻找奶牛乳房炎早期诊断的标志性蛋白,并为今后的抗病育种提供理论依据。主要试验结果如下:第一,建立了奶牛血浆蛋白质组双向电泳分离鉴定技术平台。(1)对不同的样品处理方法进行了比较。DEAE Affi-Gel兰胶柱,阴离子柱和超滤管被用于对血浆样品进行预处理,步骤增多,而且低丰度蛋白富集效果不明显。(2)使用经典的热SDS法处理血浆样品,采用pH4-7的胶条和7.5%-17.5%的梯度胶,经硝酸银染色后,建立了奶牛血浆蛋白质双向电泳图谱。此方法简单易行,稳定性好。第二,乳房炎奶牛血浆差异蛋白的分离与鉴定。分别收集健康和患病奶牛血浆,根据体细胞数将患病奶牛的血浆分为2组,一组为体细胞数大于40万个/ml小于200万个/ml,第二组体细胞数大于200万个/ml。采用双向电泳(2-DE)技术得到奶牛血浆蛋白质组图谱,PDQuest7.0软件进行分析,识别3倍差异表达蛋白斑点8个;将选取的差异蛋白质点胶内酶解后进行MALDI-TOF/TOF MS分析,经MASCOT搜索数据库鉴定为白蛋白、α-2-HS-糖蛋白、结合珠蛋白和转甲状腺素蛋白;其中结合珠蛋白在患病牛血浆中含量增加,白蛋白、α-2-HS-糖蛋白和转甲状腺素蛋白含量降低。并使用Western Blot方法在个体中验证,与双向电泳的分析结果一致。这4种差异蛋白均为急性期蛋白。α-2-HS-糖蛋白与转甲状腺素蛋白为首次在血浆中鉴定的乳房炎相关蛋白,有可能作为奶牛乳房炎发病前的检测蛋白。第三,比较奶牛分娩前后血浆差异蛋白。分别收集分娩前后一周内的奶牛血浆,进行双向电泳分析。PDQuest7.0识别3倍差异表达蛋白点12个,质谱鉴定为白蛋白和结合珠蛋白,白蛋白在产后奶牛的血浆中的含量降低,结合珠蛋白的含量增加。Western Blot检测结合珠蛋白与双向电泳的分析结果一致。产后乳房炎个体与健康个体间的结合珠蛋白的血浆含量没有差异。结合珠蛋白的产后的不敏感性与慢性疾病或急性炎症高度相关。因此,这种现象可能与奶牛围产期的免疫抑制有关。