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[研究背景与目的]胰腺癌是一种恶性程度很高的实体肿瘤,胰腺导管腺癌(Pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)是其主要的病理类型。在胰腺癌细胞中常可检测到Kras基因第12密码子的点突变KrasG12D或KrasG12V。胰腺癌的发生发展是一个涉及多因素、多步骤的复杂过程。同样,野生型Kras等位基因的状态也影响着细胞对激活的原癌基因的反应状态。杂合性缺失(Loss of heterozygosity,LOH)常在肿瘤抑癌基因中出现,原癌基因中少有LOH被观察到。目前我们和其他研究小组在PDAC转基因小鼠和人类胰腺肿瘤中发现KrasG12D-LOH,且伴有KrasG12D-LOH的肿瘤细胞更易于增殖和侵袭转移,但其具体的作用机制尚不清楚。肿瘤的发生发展离不开错综复杂的信号网络调控,其中mTOR信号通路受在调节细胞生长、增殖、分化及能量代谢等多个方面发挥着重要作用。此外,PDAC是高度恶性的乏血管肿瘤,为了模拟其在体内的微环境,本实验探究分别在常氧和缺氧培养条件下,伴有或不伴有LOH的KrasG12D对PDAC细胞增殖、侵袭等生物学行为以及能量代谢状态的影响,并初步探讨mTOR信号通路在其中的调控作用。[研究方法]1.本实验所用399细胞株和897细胞株由慕尼黑工业大学胰腺癌研究中心馈赠。399细胞株和897细胞株均来源于KrasG12D PDAC转基因小鼠,399细胞株KrasG12D的等位基因是野生型Kras,但897细胞株的KrasG12D等位基因野生型Kras丢失,即发生杂合性缺失(KrasG12D-LOH)。上述细胞株分别在常氧(5%CO2、95%空气)和缺氧(1%02、5%C02、94%N2)条件下进行培养。应用CCK-8法和细胞平板克隆形成实验检测在不同培养条件下KrasG12D-LOH对PDAC细胞增殖活力的影响。2.利用细胞划痕实验和Transwell侵袭实验检测在常氧及缺氧培养条件下,KrasG12D-LOH对PDAC细胞迁移能力和侵袭能力的影响。3.应用流式细胞术检测在不同培养条件下KrasG12D-LOH对PDAC细胞周期和细胞凋亡水平的影响。4.应用ATP含量检测试剂盒和乳酸检测试剂盒检测在不同培养条件下各组细胞的ATP含量和乳酸生成量。5.应用qRT-PCR和Western blot技术检测在常氧和缺氧培养条件下,各组细胞内mTOR上游信号通路相关分子如Akt、AMPK、REDD1、mTOR的mRNA和蛋白表达情况。[研究结果]1.CCK-8法和细胞平板克隆形成实验结果显示在常氧及缺氧培养条件下,897细胞株的增殖能力和克隆形成能力均强于399细胞株(P<0.05),提示在常氧和缺氧环境中,KrasG12D-LOH均能促进PDAC细胞的增殖。2.细胞划痕实验结果表明,在常氧及缺氧培养条件下,897细胞株的迁移能力强于399细胞株。Transwell侵袭实验结果显示,在常氧及缺氧培养条件下,897细胞株穿过铺有Matrigel的人工基底膜到达下室的细胞数均高于399细胞株,差异具有统计学意义(P<0.05),提示在常氧及缺氧培养条件下KrasG12D-LOH均可促进PDAC细胞的侵袭。3.流式细胞术结果显示,在常氧和缺氧条件下KrasG12D-LOH均能够促进细胞从G1期进入S期。但在不同氧环境中,两种PDAC细胞的凋亡情况均无明显差异。4.分别在常氧及缺氧条件下培养细胞24 h,897细胞株内的ATP浓度均高于399细胞株(P<0.05)。缺氧培养24h后,897细胞株的乳酸生成量显著高于399细胞株(P<0.05)。但常氧培养24 h后,两种细胞的乳酸生成量无明显差异(?>0.05)。5.QRT-PCR结果显示,在常氧及缺氧培养条件下,897细胞株的Akt、AMPK、REDD1和mTOR的mRNA表达量均显著高于399细胞株。Western blot结果表明,在常氧及缺氧培养条件下,KrasG12D-LOH上调Akt的磷酸化水平、REDD1的表达水平及mTOR的磷酸化水平。此外,在常氧条件下KrasG12D-LOH上调细胞内AMPK的磷酸化水平,但在缺氧条件下,两种细胞株内AMPK磷酸化水平差异无统计学意义。[结论]1.在常氧及缺氧条件下,KrasG12D-LOH均可促进PDAC细胞的增殖、迁移和侵袭,并促进细胞从G1期进入S期。2.在常氧及缺氧条件下,KrasG12D-LOH均可增加PDAC细胞内ATP的含量;在缺氧条件下,KrasG12D-LOH促进PDAC细胞乳酸的生成。3.在常氧及缺氧条件下,KrasG12D-LOH可能通过mTOR信号通路来调控PDAC细胞的能量代谢,进而促进细胞的恶性表型。