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猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)是引起猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumoniae of swine,Mps又称猪气喘病)的主要病原。该病以接触性、高度传染性、慢性、高发病率和低死亡率为特点,其主要危害是引起猪的生长受阻和饲料转化率大幅下降,而且它能够破坏呼吸道黏膜-纤毛屏障,从而引起其他致病菌的继发感染。猪肺炎支原体感染的控制需要合适的疫苗及诊断工具。两种常用的监测猪群健康状况的商品化的ELISA方法分别是单抗阻断ELISA,以及间接ELISA(IDEXX HerdChek M.hyopneumoniae,IDEXX Laboratories)。结果比较显示,两种方法具有较高的特异性,但是敏感性较低,且取决于免疫状况,据报道这两种ELISA方法包被的抗原比较单一。本实验表达了猪肺炎支原体P36、P46、P97R1及DnaK蛋白,并且合成了特异性短肽MHP366,利用多种蛋白抗原共同包被酶标板,以提高检测方法的敏感性。1.利用实验保存的强毒株Js株制备了大量标准阳性血清,同时制备了标准阴性血清；收集了不同地区不同背景的猪阴阳性血清300多份,这为猪肺炎支原体抗体检测方法的建立提供了有力的参考依据。2.利用实验室保存的猪肺炎支原体P36、P46、P97R1及DnaK阳性质粒,用大肠杆菌表达系统表达了多种免疫蛋白；同时合成了一段能区分免疫抗体与野毒感染抗体的特异性多肽MHP366.3.建立了单个蛋白的间接ELISA方法,并对方法进行了优化；在此基础上建立了多抗原共同检测猪肺炎支原体抗体的间接ELISA方法,并进行了优化,优化后的程序如下：将P46蛋白用包被液稀释至10μg/ml, P36蛋白稀释至0.5μg/ml,P97蛋白稀释至0.5μg/ml,DnaK蛋白稀释至0.5μg/ml, MHP366多肽100ng/ml,将上述蛋白及多肽按等比例混合。包被96孔酶标板,100μl/孔,37℃1h,4℃包被过夜；10%马血清,200μ1/孔,37℃封闭1h；样本1：40稀释,100μl/孔,37℃1h。羊抗猪IgG-HRP1:10000稀释,100μ1/孔,37℃30min；然后用TMB显色液在37℃作用15min,最后用2MH2S04终止反应。4.合成的特异性多肽MHP366能够特异性识别自然感染猪产生的抗体,并且能够从免疫猪中检测到感染病例,这对猪气喘病的诊断和控制非常重要,有关区分免疫抗体与感染抗体有必要做进一步的研究。5.本研究所建立的间接ELISA方法是用多个抗原蛋白作为包被抗原,与包被单个蛋白相比更能够提高检测方法的敏感性,纯化蛋白保证了检测方法的特异性,因此此方法可以更加准确地监测该病的感染状态或动物的免疫状态。