苏云金芽胞杆菌杀线虫晶体蛋白Cry5Ba沉默机制的研究及杀线虫毒力因子Bmp1的功能鉴定

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苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)能够在形成芽胞的同时在菌体内形成蛋白质性质杀虫晶体蛋白(Insecticidal crystal proteins,ICPs)组成的伴胞晶体,占细胞干重的25-30%左右。苏云金芽胞杆菌能够在产生大量的杀虫晶体蛋白时不影响细胞正常的生理过程,这与很多正向调节因子调控cry基因的表达有关。而之前的报道关于对杀虫晶体蛋白的调控机制方面大多是关于杀虫晶体蛋白的正调控机制,对于负调控机制的报道较少。苏云金芽胞杆菌YBT-1518对根结线虫有高毒力,能够产生由cry55Aa基因编码的45kDa的蛋白和cry6Aa基因编码的55kDa的蛋白所形成的米粒形晶体。同时我室还利用Bac文库克隆新基因的策略,克隆到第三个对线虫有高毒力的cry基因,它能够在无晶体突变株中形成140kDa的菱形晶体蛋白。但是在YBT-1518中通过显微镜观察和SDS-PAGE检测都观察不到cry5Ba的表达。通过高温消除质粒的方法消除了携带有cry55Aa基因和cry6Aa基因的pBMB0228质粒,发现cry55Aa基因和cry6Aa不能够影响cry5Ba的表达。通过RT-PCR检测,cry5Ba能够在稳定期转录。并且在cry5Ba基因的侧翼序列上(其上下游各20kb)都没有能够影响cry5Ba表达的负调控因子。通过对YBT-1518进行全基因组测序,对其进行生物信息学分析,我们预测到了一个sRNA-like片段:BMBsr1,它能够与cry5Ba基因的核糖体结合位点反向互补。通过异源表达,BMBsr1能够抑制cry5Ba的表达。当利用gfp基因和lacZ基因作为报告基因,BMBsr1也同样能够抑制gfp基因和lacZ基因的表达。通过碱基扫描突变,我们找到了 3个关键碱基影响BMBsr1对cry5Ba表达的调控。这种调控机制为我们发现苏云金芽胞杆菌中潜在的高毒力因子有理论的指导意义。许多苏云金芽胞杆菌菌株对线虫具有高毒力,在YBT-1518中包含三个对线虫具有高毒力的cry基因。但是我们发现晶胞混合物对线虫的毒力比纯化的晶体蛋白对线虫的毒力要高,这说明了在YBT-1518中还存在着其他的毒力因子。通过对YBT-1518中基因组序列的编码区进行分析,我们预测到了很多潜在的毒力因子。为了评价这些毒力因子的杀虫活性,我们针对Bmp1蛋白进行研究,Bmp1蛋白的结构域包含N-信号肽,一个FTP superfamily保守结构域,一个M4 Neutral protease GluZincin superfamily 保守结构域,和两个 Big-3 superfamily 保守结构域和 G+ anchor superfamily保守结构域作为C端结构域。酶活实验的结果表明Bmp1蛋白是一个金属蛋白酶,以秀丽小杆线虫作为供试虫发现Bmp1蛋白对线虫具有杀虫活性,其LC50为610±9.37μg/ml,并且Bmp1蛋白还能够增强Cry5Ba对线虫的毒力,大约增强7.9倍。并且通过用荧光物标记Bmp1蛋白喂食线虫,在激光共聚焦显微镜的观察下发现Bmp1蛋白通过线虫的口器进入食道到达线虫的中肠,并且在线虫中肠扩散,在光学显微镜的观察线虫的肠道发现Bmp1蛋白能够降解线虫的肠道组织,而Cry5Ba蛋白作为穿孔蛋白使得线虫的肠道收缩。研究结果充分说明了在苏云金芽胞杆菌中蕴藏着丰富的毒力因子,也暗示了苏云金芽胞杆菌可以作为线虫的宿主。
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