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目的：
脓毒症是儿科疾病的主要死亡原因之一,发病机制十分复杂,如不及时治疗可引起多器官功能障碍综合征(Multiple organ dysfunruction syndrome,MODS),其病情迁延可发生微循环和线粒体窘迫综合征(Microcirculatory and mitochondrial distresssyndrome,MMDS)。近年研究证实,MMDS是脓毒症的主要死亡原因之一,早期诊断、干预可防止MMDS的发生能够降低脓毒症的死亡率。线粒体是细胞能量生成的主要场所,脓毒症早期即可发生线粒体损伤,损伤机制尚不明确。肾脏和肾上腺是机体重要的器官,它们在脓毒症早期损伤影响其预后。木课题对脓毒症早期大鼠肾脏、肾上腺功能状态,线粒体功能状况、氧化应激损伤及超微形态变化进行研究；探讨脓毒症早期肾脏、肾上腺脏器功能损伤与线粒体损伤的关系以及脓毒症早期肾脏、肾上腺线粒体的损伤机制：为临床诊断、治疗脓毒症早期肾脏、肾上腺功能和线粒体损伤提供实验依据。
方法：
1.建立动物模型及分组30只SD大鼠随机分为：对照组、6小时内毒素(Lipopolysaccharide,LPS)模型组和24小时LPS模型组。模型组采用腹腔注射10mg/kg LPS建立LPS致脓毒症模型。对照组腹腔注射等容积生理盐水。
2.检测指标及方法
(1)动物一般情况
①运用鲎试剂动态浊度定量测定法测定血浆LPS水平。
②运用双抗体夹心酶联免疫吸附分析法(ELISA法)检测血清C反应蛋白的浓度。
(2)脏器功能指标：
①大鼠肾脏功能指标：运用全自动生化分析仪检测血清Cr、Urea水平。
②大鼠肾上腺功能指标：运用全自动生化分析仪检测血清蛋白水平(血清TP、ALB、GLO和A/G含量)和脂代谢相关指标(血清TG、T-CHO、HDL-C和LDL-C水平)。采用酶免疫分析法(EIA法)检测大鼠血清皮质酮浓度。分离双侧肾上腺称重,计算肾上腺脏器系数。
(3)线粒体损伤相关指标：
①采用差速离心法提取大鼠肾脏、肾上腺线粒体,JC-1染料染色,流式细胞仪(Flow cytometry,FCM)检测线粒体肿胀程度和膜电位。
②用定磷法检测大鼠肾脏、肾上腺线粒体Na+-K+ATP酶和Ca2+-Mg2+ATP酶活性。
③运用比色法检测大鼠肾脏、肾上腺线粒体氧化应激相关指标(SOD、MDA、NO、NOS、GSH)。
(4)组织病理学检查：大鼠处死后,取肾脏、肾上腺进行切片,电镜下观察。按照Flameng分级方法对肾脏、肾上腺线粒体形态学进行半定量分析。
3.统计方法
获得的数据用SPSS13.0统计软件分析,结果用均值±标准差(-x±s)表示,多组间比较采用ANOVA,方差齐性者采用LSD法分析组间差异,方差不齐者采用Games-Howell法分析组间差异。相关分析采用Pearson相关分析进行检验。α值界定为0.05。
结果：
1.动物一般情况：
所有模型组动物血浆LPS均为阳性。
与对照组和6hLPS组相比,24hLPS组血清CRP浓度显著上升(P<0.01,P<0.05)。
2.脏器功能指标：
(1)大鼠肾脏功能指标与对照组相比,6hLPS组和24hLPS组Cr水平显著升高(P＜0.01,P＜0.05);与6hLPS组相比,24hLPS组Cr明显下降(P＜0.05)。与对照组相比,6hLPS组Urea水平上升(P＜0.05)。
(2)肾上腺功能指标与对照组相比,6hLPS组和24hLPS组血清TP(P＜0.01,P＜0.01)、GLO(P＜0.01,P＜0.01)水平显著上升,A/G(P＜0.05,P＜0.05)明显下降。与6hLPS组相比,24hLPS组血清TP明显下降(P＜0.05)。
与对照组相比,6hLPS组和24hLPS组TG(P＜0.05,P＜0.01)和T-CHO(P＜0.01,P＜0.01)水平显著上升。与对照组相比,24hLPS组LDL-C水平明显上升(P＜0.05)。
与对照组相比,6hLPS组和24hLPS组肾上腺脏器系数均明显上升(P＜0.05,P＜0.01),与6hLPS组相比,24hLPS组肾上腺脏器系数显著上升(P＜0.01)。
与对照组和6hLPS组相比,24hLPS组的皮质酮浓度均显著升高(P＜0.01)。
3.线粒体损伤相关指标：
(1)大鼠肾脏、肾上腺线粒体肿胀程度和线粒体膜电位与对照组相比,24hLPS组肾脏线粒体肿胀程度明显增加(P＜0.05)。与对照组相比,6hLPS组和24hLPS组肾上腺线粒体肿胀程度均明显下降(P＜0.01,P＜0.05)。
与对照组相比,6hLPS组和24hLPS组的肾脏、肾上腺线粒体膜电位均显著下降(P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01,P＜0.01)。
(2)大鼠肾脏、肾上腺线粒体Na+-K+ATP酶和Ca2+-Mg2+ATP酶活性各组间肾脏、肾上腺线粒体Na+-K+ATP酶活性的差异不显著,不具有统计学意义(P＞0.05)。
各组间肾脏线粒体Ca2+-Mg2+ATP酶活性差异不明显(P＞0.05);与对照组相比,24hLPS组肾上腺线粒体中Ca2+-Mg2+ATP酶活性明显下降(P＜0.05)。
(3)大鼠肾脏、肾上腺线粒体氧化应激相关指标与对照组相比,6hLPS组肾脏线粒体NO水平明显下降(P＜0.05),iNOS水平明显上升(P＜0.05);6hLPS组和24hLPS组肾脏线粒体GSH含量均显著上升(P＜0.05,P＜0.01)。其余肾脏线粒体氧化应激相关指标在各组间的差异不具有统计学意义(P＜0.05)。
各组间肾上腺线粒体氧化应激相关指标的差异都不具有统计学意义(P＞0.05)。
4.大鼠肾脏、肾上腺线粒体电镜观察和线粒体形态学半定量评分与对照组相比,6hLPS组和24hLPS组肾脏线粒体电镜半定量评分显著上升(P<0.05,P<0.01)。
与对照组和6hLPS组相比,肾上腺24hLPS组线粒体半定量评分显著增加(P<0.01,P<0.05)。
5.大鼠肾脏、肾上腺线粒体肿胀程度、膜电位与其他指标的相关性分析大鼠肾脏线粒体膜电位与血清Cr浓度、肾脏线粒体SOD和Mn-SOD活性呈负相关(r=-0.424,P<0.05;r=-0.456,P<0.05;r=-0.426,P<0.05)。
大鼠肾上腺线粒体肿胀程度与血清TCHO、TG和LDL水平呈负相关(r=-0.582,P<0.01;r=-0.653,P<0.01;r=-0.453,P<0.05)。大鼠肾上腺线粒体膜电位与肾上腺脏器系数、血清GLO和血清A/G具有相关性(r=-0.612,P<0.01;r=-0.538,P<0.01;r=0.670,P<0.01)。
结论：
1.脓毒症早期肾脏功能损伤,而肾上腺功能损伤不明显。
2.线粒体膜电位可以反映脓毒症早期的线粒体损伤。脓毒症早期肾脏线粒体发生形态和功能损伤,其线粒体膜电位的损伤机制可能与线粒体中抗氧化物质改变有关。
3.脓毒症早期肾上腺线粒体可能发生可逆性损伤,这种损伤与氧化应激可能无关,其发病机制仍不明确。