目的：呼吸道合胞病毒(RSV)是婴幼儿下呼吸道感染的最重要病原，RSV也是造成老年人和免疫缺陷成人高患病率和死亡率的重要原因。目前认为60年代研制的福尔马林灭活的RSV(FI-RSV)疫苗导致的病情加剧与伴随肺部嗜酸性粒细胞浸润和IL-4、IL-5细胞因子升高的Th2型优势应答、中和抗体水平不足、以及缺乏局部免疫等有关。WHO已将RSV疫苗列为优先发展的疫苗之一，重组亚单位疫苗由于结构清楚并且相对安全而受到RSV疫苗研究者的广泛关注。　　 本室前期研究已将G蛋白的抗原活性片段G:125-225(G1)与M2蛋白的CTL表位F/M2:81-95(F/M2)融合表达，经Ni+螯合亲和层析法纯化得到重组蛋白G1F/M2，即RSV重组蛋白疫苗。以Al(OH)3为佐剂免疫小鼠后诱导了特异性CTL，而且与单独的G1免疫相比，产生了Th1/Th2混合型免疫应答，但是，肺部的Th2型细胞因子IL-4的量显著高于Th1型细胞因子IFN-γ，即Th2型应答仍占优势，RSV攻击后，肺部的炎症性病理损伤仍未完全解决。因此需寻求更适合RSV疫苗的佐剂或佐剂组合。　　 含非甲基化CpG基序的DNA或寡核苷酸（CpG ODN，以下简称CpG）是目前已知的最有潜力的佐剂，不仅能刺激固有免疫而且还能激活适应性免疫应答。CpG是TLR-9的配体，通过激活NF-κB而激活各种免疫细胞，具有广泛的免疫调节作用，特别是CpG促进树突状细胞(DCs)产生IFN-γ、IFN-α/β、IL-12、IL-18，促进Th1应答，增强CTL活性等；另外，CpG作为新生儿疫苗佐剂具有其独特的优势；这些正是RSV亚单位疫苗佐剂所需要的性质。本研究合成了硫代修饰的CpG佐剂CpG2216（A型）和CpG2006（B型）单独或与Al(OH)3组合作为佐剂，研究它们对G1F/M2增强的肺部免疫病理的调节作用及机制。　　 方法：　　 1 用E．coil表达、亲和层析纯化G1F/M2蛋白。　　 2 在Hep-2细胞上培养RSV，测定RSV浓度TCID50。　　 3 动物实验　　 3.1动物免疫：将99只雌性4周龄BALB/c小鼠随机分为9组，分别为①G1F/M2蛋白+CpG2216组，鼻腔吸入(i．n．)②G1F/M2蛋白+CpG2006组，鼻腔吸入(i．n．)③G1F/M2蛋白+CpG2216组，腹腔注射(i.p.)④G1F/M2蛋白+CpG2006组，腹腔注射(i．p．)⑤G1F/M2蛋白+CpG2216组+Al(OH)3，腹腔注射(i．p．)⑥G1F/M2蛋白+CpG2006组+Al(OH)3，腹腔注射(i．p．)⑦G1F/M2蛋白组，鼻腔吸入(i．n．)⑧G1F/M2蛋白组，腹腔注射(i．p．)⑨PBS组鼻腔吸入(i．n．)。每14天免疫一次，共免疫3次。　　 3.2体液免疫检测：末次免疫后18天取血，分离血清，用间接ELISA检测特异性抗体IgG、IgG1和IgG2a水平。　　 3.3细胞免疫检测：末次免疫后18天，每组处死6只小鼠，取脾脏分离脾细胞。ELISPOT法检测分泌IL-4和IFN-γ的淋巴细胞水平；流式细胞仪检测CD4+T或CD8+T效应记忆及中央记忆细胞；荧光实时定量检测细胞因子IFN-γ、IL-5、IL-6、1L-10、IL-12b、IL-13。　　 3.4用10-676TCID50的RSV攻击被免疫小鼠，5天后取适量肺组织两份，一份做病理切片，HE染色观察肺部病理变化；另一份肺部组织提总RNA用RT-PCR扩增RSV管家基因N来检测肺部病毒的复制情况，通过荧光实时定量RT-PCR检测细胞因子IFN-γ，IL-5，趋化因子Gro-α（中性粒细胞趋化因子），eotaxin(嗜酸性粒细胞趋化因子)，T-bet，GATA3，粘液因子gob-5，来评估疫苗的保护效果和肺部免疫病理。　　 结果：　　 1 成功诱导并纯化G1F/M2蛋白。　　 2 成功获得TCID50=10-6.76/0.1ml浓度的RSV。　　 3 体液免疫应答　　 3.1鼻腔免疫途径：两种CpG佐剂组诱导的IgG无显著性差异，与无佐剂组相比亦无显著性差异；IgG1和IgG2a分别为Th2和Th1型抗体，两佐剂组诱导的IgG1和IgG2a无显著差异，但IgG1均显著低于无佐剂组，而IgG2a显著高于无佐剂组(P＜0.05)；两佐剂组IgG1/IgG2a的比值(1.05，1.06)明显低于无佐剂组(1.25)，以上结果表明：CpG2216与CpG2006的佐剂效应无差异；CpG作为G1F/M2鼻腔免疫途径的佐剂，对体液免疫应答无增强作用，但可以调节免疫应答的类型，使Th1型应答升高，Th2型应答降低。　　 3.2腹腔免疫途径：G1F/M2+CpG2216与G1F/M2+CpG2006组诱导的抗体效价之间均无显著性差异，同样G1F/M2+A1(OH)3+CpG2216与G1F/M2+Al(OH)3+CpG2006组之间亦无显著性差异，表明CpG2216与CpG2006的佐剂效应无差异；单独CpG佐剂组的IgG1明显低于无佐剂组，而IgG2a明显高于无佐剂组(P＜0.05)，且前者IgG1/IgG2a的比值(1.00，0.97)明显低于后者(1.30)，以上结果表明：CpG对G1F/M2腹腔免疫诱导的免疫应答类型具有调节作用，有利于增强Th1型应答，减弱Th2型应答。另外，Al(OH)3加CpG双佐剂组诱导的抗体效价显著高于CpG佐剂组和无佐剂组，表明Al(OH)3佐剂能显著增强体液免疫应答。　　 CpG作为鼻腔免疫和腹腔免疫途径的G1F/M2的佐剂，都能调节免疫应答的类型，但腹腔免疫途径效果更好。　　 4 细胞免疫应答　　 4.1效应细胞分泌的细胞因子检测：第三次免疫后18天，取小鼠脾细胞，提取总RNA，用实时定量RT-PCR扩增Th1型细胞因子IFN-γ和IL-12b、Th2型细胞因子IL-5、IL-6、IL-10、IL-13的基因，结果显示各实验组的细胞因子的表达水平与PBS对照的表达水平均无显著性差异（数据未列出），表明免疫后第18天脾细胞中没有被激活的效应T细胞，只有处于G0期的初始T细胞和记忆T细胞。　　 4.2 CD4+和CD8+的效应记忆和中央记忆细胞的百分率：　　 CD4+的脾细胞中CD44和CD62L的表达情况：(1)鼻腔免疫途径，CpG佐剂组和无佐剂组的结果无差异，均产生了大量的CD44+单阳性细胞（TEM，效应记忆细胞），而几乎没有CD44+CD62L+双阳性的TCM细胞；(2)腹腔免疫途径，G1F/M2+CpG2216组、G1F/M2+CpG2006组和G1F/M2+CpG2216+A1(OH)3组、G1F/M2+CpG2006+Al(OH)3组既诱导产生了CD44+单阳性TEM细胞，也产生了CD44+CD62L+双阳性的TCM细胞。其中G1F/M2+CpG2006组产生的TCM细胞与其他组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。　　 CD8+的脾细胞中CD44和CD62L的表达情况：鼻腔免疫组仅产生CD44+单阳性TEM细胞，而腹腔免疫组G1F/M2+CpG2216组、G1F/M2+CpG2006组和G1F/M2+CpG2216+Al(OH)3组、G1F/M2+CpG2006+Al(OH)3组既诱导产生了CD44+单阳性细胞，也产生了CD44+CD62L+双阳性的细胞。　　 这些结果表明：作为鼻腔免疫佐剂CpG主要促使G1F/M2诱导效应记忆细胞，而作为腹腔免疫佐剂则有助于G1F/M2刺激产生中央记忆细胞，其中CpG2006效果最显著。4.3分泌IFN-γ和IL-4的淋巴细胞的水平：　　 取脾细胞，用G1F/M2蛋白体外刺激，激活记忆细胞，使其分泌细胞因子。结果显示：(1)鼻腔免疫佐剂组分泌IFN-γ和IL-4的淋巴细胞数均显著多于无佐剂组(P＜0.05)；无论是CpG佐剂还是无佐剂组，分泌IFN-γ的淋巴细胞数显著多于分泌IL-4的淋巴细胞数(P＜0.05)，即Th1优势型免疫记忆。(2)腹腔免疫各佐剂组均诱导了大量的分泌IFN-γ的淋巴细胞，显著多于无佐剂组(P＜0.05)，且CpG2006组的细胞数显著多于CpG2216组，CpG2006+Al(OH)3组显著多于CpG2216+Al(OH)3组(P＜0.05)；对应的各组所产生的分泌IL-4的淋巴细胞数均显著少于分泌IFN-γ的淋巴细胞数(P＜0.05)，即各组均诱导了Th1优势型免疫记忆。但是，CpG与Al(OH)3混合使用组均诱导了大量的分泌的IL-4淋巴细胞，显著多于其他各组，而单纯CpG组的分泌IL-4淋巴细胞数与无佐剂组之间无显著性差异，表明CpG+Al(OH)3同时增强Th1和Th2型免疫记忆。CpG佐剂组分泌IFN-γ和IL-4的淋巴细胞数的比值(42.00，20.43)明显高于无佐剂组(5.96)，而CpG+Al(OH)3佐剂组(4.24，3.16)低于无佐剂组，表明CpG佐剂促进G1F/M2蛋白疫苗诱导Th1记忆细胞。　　 结果表明无论是鼻腔免疫还是腹腔注射免疫，CpG单独作为佐剂或与Al(OH)3联合作为佐剂均诱导了Th1为主的Th1/Th2混合应答；CpG与Al(OH)3联合做为佐剂可同时增强Th1型和Th2型免疫记忆；而在诱导Th1型优势免疫记忆方面，CpG单独使用强于两种佐剂联合使用，且腹腔注射免疫比鼻腔免疫效果好。　　 5 RSV攻击被免疫小鼠后，肺部的病毒复制和免疫病理　　 5.1肺部病毒复制情况：用半定量RT-PCR和实时定量RT-PCR检测肺组织RSV管家基因N的表达量，结果见图1和表1：PBS组肺组织N基因的表达量显著高于各实验组；有佐剂的各组N基因的表达量显著低于无佐剂组。这些结果表明：当RSV感染时，无佐剂的G1F/M2、CpG以及CpG+A1(OH)3佐剂化的G1F/M2均能对被免疫小鼠起到保护作用，而且佐剂化的G1F/M2保护效果更好。　　 5.2肺部炎症性介质、Th1/Th2细胞因子和转录因子的表达：用实时定量RT-PCR检测肺组织中这些分子的表达，CpG2006+ G1F/M2(i．p．)的IFN-γ/IL-4比值显著高于其他各组，表明该组呈现显著的Th1应答；另外该组的嗜酸性粒细胞和中性粒细胞趋化因子eotaxin和Gro-α均显著低于无佐剂组和联合佐剂组，表明该组的炎症细胞浸润可能低于无佐剂组和联合佐剂组。从粘液因gob-5的表达情况看，鼻腔免疫显著低于腹腔免疫组。　　 5.3病理切片检测：CpG2006+ G1F/M2(i．p．)组的炎性细胞浸润比显著少于其他各组。　　 结论：　　 1 CpG与Al(OH)3联合使用，对G1F/M2诱导的特异性体液免疫应答有显著增强作用。CpG作为G1F/M2的佐剂，对体液免疫应答无增强作用，但可以调节免疫应答的类型，使Th1型应答升高，Th2型应答降低。　　 2 CpG佐剂可显著增强G1F/M2诱导的Th1型免疫记忆，而且CpG2006比CpG2216效果更好；CpG与Al(OH)3联合使用，可同时增加Th1和Th2记忆细胞。CpG通过腹腔注射可以显著刺激CD4+T细胞和CD8+T细胞的CD44+CD62L+双阳性的中央记忆细胞。　　 3 各免疫组小鼠对RSV都起到了很好的保护作用，而且佐剂化的G1F/M2保护效果更好。　　 4 CpG2006+G1F/M2免疫的小鼠，当RSV攻击时肺部的免疫病理反应最弱。