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【背景】胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，据2011年CAcancer报道，胃癌发病率位居第四位，死亡率位居第二位[1]。化疗是进展期胃癌的主要治疗方式之一[2]，然而，多药耐药现象的发生严重影响了胃癌患者的治疗效果。自1970年Bielder提出多药耐药（MDR）概念[3]，虽然已经发现许多多药耐药相关分子，如ABC转运体家族P-gp、 MRP、BCRP，GSH/GST，P53，TopoII等[4-7]，但仍不能完全解释胃癌多药耐药现象，提示胃癌细胞中仍然存在一些未知的耐药相关分子及机制。因此，寻找新的逆转胃癌耐药的关键分子，可望成为逆转胃癌耐药的有效途径。基于此，前期我们课题组从细胞表型着手，利用噬菌体呈现肽库技术，以正常胃粘膜上皮永生化细胞GES及胃癌药敏细胞SGC7901为阴性细胞，采用消减筛选结合功能筛选的方法获得能够特异结合并内化入胃癌耐药细胞的短肽GMBP1，ETAPLSTMLSPY。免疫荧光结果显示，其结合受体在胃癌耐药细胞高表达，提示它可能与胃癌MDR密切相关。本课题拟研究该短肽在胃癌MDR中的作用，鉴定其结合受体，并深入研究与其相互作用的分子及其调控关系，旨在进一步阐明胃癌耐药的新机理，为耐药性胃癌的分子靶向治疗提供新靶标。【目的】1.研究GMBP1与耐药细胞的特异结合能力，分析其在胃癌MDR中的作用。2.筛选GMBP1的结合受体，为探讨GMBP1在胃癌MDR的作用机制奠定基础。3.鉴定GMBP1的结合受体，初步分析GMBP1及其受体在胃癌多药耐药中的作用机制。【方法】1.免疫细胞化学染色方法验证GMBP1与胃癌耐药细胞的结合特性，明确受体的亚细胞定位。2. MTT实验检验GMBP1对细胞生长的影响。3.体外药物敏感实验检测GMBP1作用胃癌耐药细胞后，细胞对肿瘤化疗药物IC50值的影响。4.流式细胞技术及Hoechst实验分析GMBP1对抗肿瘤药物诱导耐药细胞凋亡的影响。5. Western blot初步鉴定GMBP1结合受体的理化性质。6.免疫共沉淀法纯化和富集GMBP1结合的受体蛋白，银染、胶内酶解、质谱分析等方法初步筛选GMBP1的结合受体。7.激光共聚焦、Western blot、siRNA技术进一步验证确认GMBP1的结合受体。8. Western blot方法检测GMBP1作用耐药细胞后耐药相关分子P-gp、MRP和凋亡相关分子Bcl-2、Bax的表达变化情况。9. Western blot检测GMBP1作用耐药细胞或过表达GRP78后，GMBP1结合受体的表达变化，并通过流式细胞技术检测相应过表达GRP78的耐药细胞对抗肿瘤药物诱导细胞凋亡的影响。10. Western blot检测下调GMBP1结合受体的表达后耐药相关分子P-gp和凋亡相关分子Bcl-2、Bax的表达情况，并用流式细胞技术检测下调GMBP1结合受体的耐药细胞对化疗药物诱导细胞凋亡的影响，初步分析GMBP1及其受体在胃癌多药耐药中的作用机制。【结果】1. GMBP1对胃癌耐药细胞生物学行为的影响。1）免疫细胞化学及免疫荧光实验结果证实，GMBP1能与胃癌耐药细胞特异性结合，其亚细胞定位于胞膜和核周胞浆。2） MTT及体外药物敏感实验显示，GMBP1本身对胃癌耐药细胞增殖无明显影响，但其能够有效地降低耐药细胞SGC7901/VCR及SGC7901/ADR对长春新碱、5-FU、MMC、CCDP、阿霉素等药物的IC50值，提高药物敏感性。3） Hoechst及流式细胞仪检测细胞凋亡发现，GMBP1能够增加胃癌耐药细胞对化疗药物的敏感性，促进细胞发生凋亡。2. GMBP1特异性结合受体的co-IP筛选1） Western blot实验证实GMBP1结合受体的分子量大小为130KD及80KD左右。2）免疫共沉淀及质谱分析结果初步显示，78KD葡萄糖调节蛋白GRP78有可能为GMBP1结合受体候选分子。3. GMBP1结合受体的鉴定及其在胃癌耐药中的作用机制研究1）激光共聚焦及western blot分析显示，GRP78与GMBP1结合受体在耐药细胞的亚细胞定位及其蛋白表达水平一致， GRP78在胃癌耐药细胞系高表达。2） Western blot结果显示，GMBP1作用耐药细胞后，明显降低P-gp、Bcl-2的表达，增高Bax的表达，而MRP则无明显表达变化。3） Western blot及流式结果显示，GMBP1能下调GRP78的表达，并相应提高耐药细胞对化疗药物的敏感性，诱导凋亡发生。4） Western blot及siRNA等实验初步证实，GMBP1-GRP78复合物能通过调节耐药相关分子P-gp发挥逆转胃癌耐药的功能。【结论】1. GMBP1能与耐药细胞特异性结合，亚细胞定位于胞浆及胞膜。2. GMBP1本身不影响耐药细胞的增殖，但能增加耐药细胞对化疗药物的敏感性，诱导细胞凋亡。3.葡萄糖调节蛋白GRP78为GMBP1特异性结合的受体分子。4. GMBP1逆转胃癌多药耐药可能机制：一方面通过下调GRP78的表达从而抑制耐药相关分子P-gp的表达，另一方面通过其他通路降低凋亡相关分子Bcl-2/Bax的比例发挥功能。而其具体机制尚待进一步深入研究。