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疫苗是防治弓形虫病的有效手段之一,弓形虫疫苗研制经历了全虫疫苗、虫体特异组分疫苗、基因工程疫苗、DNA疫苗4个发展阶段。弓形虫DNA疫苗较传统疫苗虽有诸多优势,但尚处于研究的起步阶段,单价DNA疫苗可诱导机体对弓形虫感染产生细胞免疫和体液免疫,但免疫效果并不十分理想,联合多价DNA疫苗将是弓形虫疫苗今后的发展趋势。此外,弓形虫DNA疫苗的免疫保护机制和安全性还不十分清楚,进一步探讨疫苗免疫机制及其对真核细胞正常基因表达调控的影响,将有助于研制高效、安全、实用的弓形虫DNA疫苗。一、弓形虫p30、p24 DNA疫苗pVAX1-p30、pVAX1-p24的构建及免疫功能研究本研究利用PCR技术扩增出P30和P24基因片段,分别克隆入pVAX1载体,对重组质粒pVAX1-p30、pVAX1-p24进行PCR、双酶切和测序鉴定;并将重组质粒pVAX1-p30、pVAX1-p24和空载体pVAX1转染入小鼠巨噬细胞(RAW264.7),建立体外真核细胞瞬时表达系统,应用免疫细胞化学染色(SP法)检测表达产物p30、p24抗原蛋白;最后将pVAX1-p30、pVAX1-p24DNA疫苗经肌内注射免疫BALB/c小鼠,建立弓形虫攻击感染小鼠模型,观察小鼠的生存时间,检测血清抗弓形虫特异性IgG抗体,ELISA法测定小鼠IFN-γ、IL-2、IL-4细胞因子水平,MTT法测定免疫鼠NK细胞杀伤率,流式细胞技术测定CD4+、CD8+T细胞亚群。结果显示弓形虫DNA疫苗pVAX1-p30和pVAX1-p240构建成功,并能够在小鼠细胞巨噬细胞中表达p30、p24抗原蛋白。在弓形虫攻击感染小鼠模型研究中发现,pVAX1-p30+pVAX1-p24联合免疫组BALB/c小鼠平均存活时间达到(7.60±0.74)d,与对照组(4.50±0.22)d相比明显延长(Log Rank Statistic,P<0.05);血清中抗弓形虫特异性IgG的OD值(0.856±0.083)高于对照组(0.529±0.073)(F=17.412,P<0.05);血清IFN-γ水平(853.77±66.74)pg/ml、IL-2水平(192.24±19.90)pg/ml高于对照组(598.74±67.50、89.44±10.66)pg/ml(F=20.528,F=56.393 , P < 0.05) ; pVAX1-p24+pVAX1-p30组脾细胞CD4+细胞比例(37.42±4.84)%,与对照组(48.59±1.85)%间差别具有统计学意义(F=16.736,P<0.05),CD8+细胞比例(34.94±5.30)%上升,与对照组(26.91±2.12)%差别具有统计学意义(F=6.896,P<0.05);CD4+/CD8+淋巴细胞比值(1.09±0.19)与对照组(1.81±0.14)差别具有统计学意义(F=27.678,P<O.05),且低于pVAX1-p24、pVAX1-p30组(1.66±0.13,1.56±0.22);NK细胞杀伤率(64.15±7.71)%,高于对照组(46.81±3.96)%及pVAX1-p24、pVAX1-p30组[(52.03±6.96)%、(55.95±7.37)%(]F=9.816, P<O.05)。结果提示,弓形虫DNA疫苗pVAX1-p30、pVAX1-p24的联合应用对弓形虫感染小鼠具有免疫功效,且免疫效果优于pVAX1-p24、pVAX1-p30单独使用,可明显提高小鼠的细胞免疫及体液免疫水平。二、弓形虫p30、p24双基因DNA疫苗pBudCE-p24-p30的构建及其对小鼠巨噬细胞基因表达谱的影响本研究将p30、p24两条基因片段克隆并定位于真核表达载体pBudCE4.1上,构建pBudCE-p24、pBudCE-p30以及pBudCE-p24-p30双基因重组质粒DNA。将重组质粒pBudCE-p24、pBudCE-p30以及pBudCE-p24-p30和空载体pBudCE4.1转染入小鼠巨噬细胞,建立体外真核细胞瞬时表达系统,应用免疫细胞化学染色(SP法)检测表达产物p30、p24抗原蛋白。并利用Affymetrix基因芯片研究p24及p30,特别是p24及p30协同作用对真核细胞正常基因表达调控的影响,对异常表达的基因进行检测分析,并以RT-PCR技术对表达谱基因芯片结果进行验证。结果显示重组质粒pBudCE-p24-p30、pBudCE-p24、pBudCE -p30构建成功,并能够在小鼠细胞巨噬细胞中表达p30、p24抗原蛋白。Affymetrix表达谱基因芯片检测发现,双基因DNA疫苗pBudCE-p24-p30对小鼠巨噬细胞正常基因表达调控的影响不显著,pBudCE-p24-p30转染后小鼠巨噬细胞共有16个基因表达出现上调或下调,上调的基因有Pdlim4、Pcdh7、CAMK4、Nudcd2等9个基因,下调的基因有E2F5、Rpn1、Sh3bgrl等7个基因。其中与基因转录有关的基因6个,与信号转导有关的基因6个,部分功能未明的基因4个。RT-PCR检测结果与表达谱基因芯片检测结果完全吻合。